טיפול של רצועות ליגמנט עם תרגיל ממוזג בסרום: רקמות תרגום הנדסה דגם
Summary
אנו מציגים מודל של רקמת ליגמנט שבה מבנים תלת-מימדיים מטופלים בסרום המותאם על-ידי התרגיל האנושי ונותחו עבור תוכן קולגן, פונקציה וביוכימיה סלולרית.
Abstract
ניסויים במבחנה חיוניים להבנת מנגנונים ביולוגיים; עם זאת, הפער בין תרבות רקמת monolayer ופיזיולוגיה אנושית הוא גדול, ואת התרגום של הממצאים הוא לעתים קרובות עניים. לכן, יש מספיק הזדמנויות עבור גישות ניסיוניות אלטרנטיביות. כאן אנו מציגים גישה שבה תאים אנושיים מבודדים מן שרידי רקמת השריר הקדמית של האדם הקדמי, מורחבת בתרבות, ומשמשת ליצירת רצועות מהונדסות. פעילות גופנית משנה את הסביבה הביוכימית בדם, כך שהפונקציה של רקמות רבות, איברים ותהליכים גופניים משופרים. בניסוי זה, התקשורת תרבות הבנייה ליגמנט היה להשלים עם נסיוני האדם בסרום כי כבר "מותנה" על ידי תרגיל. לכן ההתערבות רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית, שכן רקמה ניסיונית נחשפת לסביבה הביוכימית האנדוגנית המלאה, כולל חלבונים מחברים ותרכובות נלוות, אשר ניתן לשנותם במקביל לפעילות שלסוכן לא מוכר של עניין. לאחר הטיפול ניתן לנתח מיתרים מהונדסים לתפקוד מכני, לתוכן קולגן, למורפולוגיה ולביוכימיה סלולרית. בסך הכל, ישנם ארבעה יתרונות עיקריים לעומת התרבות monolayer המסורתית מודלים של בעלי חיים, של המודל הפיזיולוגי של רקמות ליגמנט זה מוצג כאן. ראשית, מבנים רצועות הם תלת מימדיים, המאפשרים תכונות מכניות ( כלומר , פונקציה) כגון מתח מתיחה האולטימטיבי, עומס מתיחה מקסימלי, מודולוס, כדי לכמת. שנית, את enthesis, את הממשק בין boney אלמנטים sinew, ניתן לבחון בפירוט ובתוך הקשר פונקציונלי. שלישית, הכנת מדיה בסרום שלאחר האימון מאפשרת את ההשפעות של הסביבה הביוכימית הממושכת, שאחראית על מגוון רחב של הטבות בריאותיות של פעילות גופנית, להיחקר באופן לא משוחק. לבסוף, מודל ניסיוני זה מקדם מחקר מדעי באופן אנושי ואתי על ידי החלפת השימושחיות, המנדט העיקרי של המכון הלאומי לבריאות, המרכז לבקרת מחלות, ומנהל המזון והתרופות.
Introduction
פציעות טלאי ופציעות הן נפוצים ויכולים להשפיע על הניידות הרגילה ועל איכות החיים. התערבות כירורגית הוא הכרחי לעתים קרובות אבל יכול להיות הצלחה מוגבלת ומגוונת 4 , 5 . ההבנה הנוכחית של איך הגידים והרצועות לפתח, לבש, להגיב על פגיעה אינה שלמה, ולכן מודלים מחקר יעיל נדרשים כדי לספק תובנה בפיתוח טיפולים יעילים יותר 5 . כדי להתמודד עם פער הידע הזה, ניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים, אך במחקרים של vivo מורכבים מטבעם עם קושי בשליטה על הסביבה ומיקוד התערבויות ישירות לרקמות המיועדות. לעומת זאת, הסביבה הניסויית יכול בקלות להיות נשלט, פיקוח במבחנה עם התרבות המסורתית monolayer התא. עם זאת, טכניקה זו עשויה oversimplify הסביבה הכימית מכני ולכן לא יכול recapituמאוחר ההתנהגות vivo של התאים. הנדסת רקמות הוא מסוגל להתחתן עם היתרונות של המורכב בסביבה vivo במודלים של בעלי חיים עם שליטה של הסביבה חוץ גופית מספק כלי נוסף ללמוד פיזיולוגיה. בנוסף, חמושים עם הבנה טובה יותר של התפתחות הליגמנט, הנדסת הרקמות עשוי גם לספק מקור של רקמה שתל כאשר שחזור כירורגי נדרש 6 . לכן, השיטה המתוארת כאן מאמת רקמות במבחנה 3D מהונדסים שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד פונקציה ליגמנט מורפולוגיה.
פיברין מבוססי גיד או מבנה הרצועות שימשו כמודל במבחנה כדי ללמוד תהליכים פיזיולוגיים כולל קולגן פיברילוגנזה 7 ופיתוח גיד 8 , כמו גם יישומים translational שבו התועלת שלהם כמו רקמות השתל הוערך מודל כבשים של הקדמי cruCial ligament (ACL) שחזור 9 . המעבדה שלנו הקימה בעבר מודל ליגמנט מהונדס תלת-ממדי המפרש שני מכחולים, חומר סידן פוספט-חלופי, עוגני בטון. מודל זה יכול להיות נתון בתנאים ניסויים שונים בקלות על ידי השלמת התקשורת תרבות עם גורמים ביולוגיים 10 או החלת גירוי מכני 11 . חשוב לציין, מודל זה העצם אל העצם מאפשר ניתוח מעמיק של enthesis, את הממשק בין בוני אלמנטים sinew, אשר רגישים לפציעה.
המחקר הדגיש כאן 1 כדי להציג את המתודולוגיה הזו, היינו מעוניינים בהשפעה של שינויים המיוצרים על ידי פעילות גופנית בסביבה הביוכימית על תפקוד הליגמנט. פעילות גופנית משפרת את תפקוד הסלולר ואיבר במגוון רחב של רקמות בכל הגוף 2 , 3 , </suP> 12 , אפקט שניתן לייחס לשחרור של ידועים שונים (למשל, IL-6 13 , IL-15 14 , מטאורין כמו 15 , אקסוסומים 16 , 17 ), וכן גורמים ביוכימיים אחרים לא ידועים שפורסמו לתוך מחזורית מערכתית . יתר על כן, הסביבה שלאחר הביוכימיה מועשרת בהורמונים מגיב פעילות גופנית, ששחרורו מגורה על ידי גירוי מערכת העצבים הסימפתטית של בלוטות הפרשה ( למשל , cortisol ו catecholamines מ בלוטת יותרת הכליה 18 , הורמון גדילה של יותרת המוח הקדמית 19 ). עם זאת, אני vivo n , אי אפשר להבדיל את ההשפעות של גירוי מכני של פעילות גופנית מ מימוש- induced שינויים ביוכימיים. בעוד כמה מחקרים מאופיינים עלייה צפויה של הורמונים במחזור מסוים ציטוקינים בתגובה למימושכפי שצוין לעיל, ישנם גורמים רבים מדי, ידועים ובלתי ידועים, לסכם בנאמנות במבחנה. כלומר, בידוד כמה גורמים עבור מחקר במבחנה מספקת מספקת מענה המורכבות של התגובה הביוכימית. במחקר זה, חקרנו כיצד שינויים בסרום ביוכימי בסרום, הנגרמים על ידי פעילות גופנית, משפיעים על פונקציית הרצועות המהונדסות. כדי לבודד את ההשפעות של השינויים הביוכימיים, השגנו סרום ממשתתפים אנושיים לפני ואחרי התקף של פעילות גופנית התנגדות והשתמשו בו לטפל ברצועות מהונדסים 3D שנוצר באמצעות fibroblasts היברידית הקדמית (ACL) היברידית הקדמית (ACL). באמצעות מודל זה, אנו יכולים לקבל נתונים פונקציונליים, כולל השפעות על תכונות מכניות ותוכן קולגן, כמו גם לכמת את ההשפעות על איתות מולקולרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב היד הנוכחי מתאר מודל של רקמת ליגמנט שהיא פלטפורמה ניסיונית שימושית לחוקרים עם קשת רחבה של נושאים מחקריים, החל בפיתוח רקמות ועד לשאלות טרנסלוציוניות / קליניות. מודל הליגמנט המהונדס המתואר כאן מבוסס על פרוטוקול רב-תכליתי שניתן להתאימו בנקודות שונות לאורך כל תהליך העבודה ( איור 1 ודיון ). יתר על כן, הטבע רדוקציוניזם מטבעו של הסביבה חוץ גופית יכול להיות קרוב יותר לתחום הפיזיולוגי על ידי השלמת התקשורת להאכיל עם מותנה האדם או בסרום החיה.
מבנים יכול להיווצר באמצעות fibroblasts ממגוון מקורות
בעוד המתודולוגיה ותוצאות נציג המוצגים כאן מבוססים על השימוש fibroblasts ACL העיקרי, פרוטוקול בידוד התא יכול להיות מותאם לאיסוף סוגים אחרים של fibroblasts ראשוני. כפי שתוארבאיור 4 , רצועות מהונדסות שנוצרו עם תאים ראשוניים המבודדים מתורמים אנושיים צעירים מראים שונות נמוכה של התורם. תאים ראשוניים מוגבלים על ידי בידוד ראשוני והגבלת מעבר; את השימוש של שורות תאים עשוי לשפר את reproducibility של ניסויים. השימוש בסוגי תאים אחרים עשויים לדרוש שינויים בתרבית התקשורת תאים וגיבוש ג'ל פיברין. לדוגמה, ראינו כי בתאי גזע mesenchymal האדם (MSCs) אינם מסוגלים ליצור רקמות ליניאריות בין עוגני צמנט brushite במשך 2 שבועות בעוד הסוס מעולה דיגיטליות מכופף פיברובלסטים הגידים, תאי מוח העצם תאים סטרומה, אפרוח חזה fibroblasts , ו Murine C3H10T1 / 2 MSCs במהירות החוזה לעכל את הג 'ל פיברין כדי ליצור רקמה ליניארית (תצפיות שלא פורסמו). ניגוד זה עשוי להיות תוצאה של הבדלים בקבלנות התא, התפשטות, וייצור אנזימים פיברינוליטיים.
יישום של כימיקליםו גירוי מכני
בשיטה המתוארת כאן, רקמות מבוססות פיברין סביב עוגנים צמנט brushite, ומאפשרת את היישום של גירוי מכני באמצעות bioreactor מתיחה 11 , כמו גם עבור בדיקות מתיחה בסוף הנקודה. הנוכחות של המלט brushite מרכך רקמות רכות (enthesis) גם מהווה הזדמנות לחקירה נוספת ושיפור 22 , 26 (ראה סעיף יישומים קליניים להלן). זה בסביבה חוץ גופית , התרומה של גורמים כימיים מכניים ניתן לזהות בקלות רבה יותר; דוגמה לכך מוצגת בתרשים 5 , לפיה הופרדה ההשפעה של סביבת הסרום לאחר האימון מהגירויים המכניים של התרגיל. מחקרים פיילוט עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע מסגרת זמן של התערבויות ניסיוניות, הרכב הטיפולים, ואת נקודות הקצה המתאימות כדי לצפות שינוי הנצפה. FoR, במחקר שלאחר הלידה 1 , אורך הטיפול הניסיוני הוגבל על ידי אספקת הסרום ששימש להשלמת חומרי התקשורת, שממנה הורכבו מבנים בכל יום שני. יתר על כן, במהלך השבוע השני של התרבות, התקשורת התרבותית נוספה עם מנוחה או לאחר פעילות גופנית בסרום עם חומצה אסקורבית ו- L-proline נשמר תוך TGF-β1 הוסרה. TGF-β1 הוא גורם גדילה פרו-פיברוטי ידוע, אשר מגביר בסרום לאחר פעילות גופנית 27 . לכן, כדי למנוע הסתרת השפעות TGF-β1 הקשורות לסרום שלאחר האימון, ציטוקין זה לא נשמר בתקשורת התרבותית.
זה מודל הנדסה מהונדסים יכול לשמש גם כדי לבדוק את ההשפעה של מתיחה מכנית. על ידי הנדסה לאחור הדוגמאות הדגם להחזיק את המברשת המלט עוגן מסתיים (בדומה בודק מתיחה uniaxial מתואר באיור 1 ), bioreactors למתוח יכול להיות מתוכנן כדי להתאים eng רצועות מוטות. המעבדה שלנו השתמשה בעבר מודל זה כדי לחקור את התגובה איתות מולקולרי של רצועות מהונדסים למתוח מתיחה uniaxial ב bioreactor 11 בהתאמה אישית אשר יספק הבנה טובה יותר עבור תכנון רציונלי של פרדיגמה למתוח במבחנה או אפילו, פוטנציאלית, in vivo מתיחה / פעילות / יישומים טיפוליים.
הערכת רצועות מהונדסות
כמו בתרבות monolayer המסורתית, 3D בונה יכול להיות assayed עבור ביטוי הגן / חלבון; בנוסף, מורפולוגיה 3D שלהם גם מספק את ההזדמנות להעריך שינויים פונקציונליים מורפולוגיים ומבנים יכול להישמר בתרבות לטווח ארוך מחקרים ( איור 3 ). בעוד שרצועות מהונדסות אינן מקבילות לרצועות הילידים, הבוגרות, הן נושאות דמיון לגידים מתפתחים / מיתרים ומתנהגים באופן דומה לרקמות הילידים בתגובה לחומרים מזינים"26, גורמי גדילה 10 , הורמונים 25 , ופעילות גופנית 11 , 28 לכן, בעוד שהזהירות מוצדקת לפני ביצוע הכללות רחבות מכל מודל במבחנה , תוצאות מבחני רצועות ליגמנט עשויות לחשוף או להודיע על מנגנון פיזיולוגי מסוים שעלול להיות אחר בלתי אפשרי לחקור in vivo.
מוסף מדיה להאכיל עם סרום מותנה עבור מודל גמיש ודינמי עם יישומים נרחבים
מטבולום הסרום האנושי הוא תרכובת של 4,500 מרכיבים הכוללים, אך לא רק, גליקופרוטאינים, ליפופרוטאינים, נגזרות שומנים, מצעי אנרגיה, מטבוליטים, ויטמינים, אנזימים, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, ושפע של אבני בניין / ביניים. 29 בדיקה נוספת של מטבוליום בסרום אנושי על פי מחלקות מורכבות 29 מגלה תוספותOnal היתרונות של שילוב נסיוב ניסיוני לתוך ניסויים במבחנה. כלומר, רוב 4500 ~ תרכובות בסרום הם הידרופובי או נגזר שומנים בדם, מדגיש את החשיבות של חלבונים מחייב עבור תחבורה / solubilization. מכאן נובע כי ניסוי מסובך אנדיוגנית התחבורה הדינמיקה התחבורה, ומכאן bioavailability אינטראקציות היעד מורכב, יהיה כמעט בלתי אפשרי. לכן, נסיוב ניסיוני יעיל במיוחד עבור מחקר של תרכובות שידוע כי הם תלויים מולקולות אביזר עבור solubilization, תחבורה, יעד מחייב, מנגנון הפעולה.
למעבדה שלנו יש עניין רב בתועלת הבריאותית של פעילות גופנית. פעילות גופנית משפרת את תפקוד הסלולר והאיבר במגוון רחב של רקמות בכל הגוף 12 , תופעה שניתן לייחס למגוון גורמים (לדוגמה, IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 ,Exosomes 16 , 17 ) אשר משוחררים לתוך מחזורית מערכתית. הסמינר הביוכימי שלאחר ההתעמלות משקף גורמים המשוחררים הן כתוצאה מהורמונים של שרירים, והן כתוצאה משחרור של מערכת העצבים הסימפתטית של בלוטות הפרשה ( למשל , קורטיזול וקטכולאמינים מבלוטת יותרת הכליה 18) . הורמון מן יותרת המוח הקדמית 19 ). לאחרונה השתמשנו במודל של סרום לפני ואחרי פעילות גופנית כדי לחקור את ההשפעות של האימון הביוכימי הממושך על רקמות מהונדסות. 1 למרות שנותרו שאלות מחקר רבות הקשורות למחקר גופני, המודל אינו מוגבל בדרך זו. לדוגמה, ניתן להשיג סרום, ממקורות בעלי חיים או ממקורות אנושיים, בעקבות התערבויות תזונתיים או פרמקולוגיות, או מקבוצות גיל שונות או מאוכלוסיות קליניותS. בדרך זו, תרכובות אקזוגניות או אנדוגניות של עניין יהיו נוכריות בסרום ובמדיה הטיפולית, בכמויות ביו-זמינות ויפעלו עם רקמת המטרה בתיאום עם הסביבה האנדוגנית ( כלומר , בהקשר פיזיולוגי יותר). גישה זו היא דינמית, שכן קיימת סבירות גבוהה כי התערבות נתונה תפעיל אפקט רב-אברתי (ורב-תרכובות), ולפיכך יחול שינוי בסביבה הפיזיולוגית. בעוד גישה זו מציבה אתגרים מסוימים, שכן משתנים ביוכימיים מערכתיים מרובים משתנים בו זמנית, זוהי גישה שעשויה לסייע להתגבר על החסרונות של מתודולוגיה ניסיונית רדוקציוניסטית בלבד 31 , 32 . יחדיו, ביצוע סרום מותאם יחד עם רקמות מהונדסות ( in vitro biomimetic ) רקמות יכול לשמש ככלי פיזיולוגיה, תזונה ושאלות מחקר קליני.
<stronG> יישומים קליניים רבים
המודל להנדסת רקמות המוצג כאן יכול לשמש כדי לחקור שאלות אנטומיות קליניות מחקר מסורתיים במודלים חוץ גופית לא יכול. רצועה או גיד in vivo מכיל רך ל-קשה רקמת המעבר האזור שנקרא enthesis. את enthesis, אשר חשוף פגיעה מכנית הקשורות 33 , ניתן ללמוד בחתך רוחב באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה היסטוכימית אלקטרונים 22 , 26 . זה ממשק ייחודי חשוב כפליים עבור אלה עם ניידות נמוכה או מוגבלת מאז חוסר פעילות גופנית פוגעת ביכולת של רקמת חיבור להעברת עומס לאזורים של ציות נמוך עד 34 , וכתוצאה מכך בסופו של דבר ירידה כללית של תאימות רקמות סיכון מוגבר לפציעה.
המעבדה שלנו השתמשה לאחרונה זה מודל הנדסת רקמות 25 </ Sup> כדי להדגים אוכלוסייה אחרת, ספורטאיות, הנמצאות בסיכון לפציעות רקמות חיבור: שכיחות פציעות ACL גדולה פי חמישה בקירוב מזכריהן הגברים 35 . מנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס הפער בין המינים בפגיעה נחקרו על ידי טיפול במבני ליגמנט עם ריכוזים פיזיולוגיים של הורמון המין הנשי, אסטרוגן, בריכוזים שחיקו את השלבים במחזור החודשי. מעניין, ריכוז גבוה של אסטרוגן מעכב את ביטוי הגן ופעילות של lysl oxidase, האנזים העיקרי האחראי ליצירת ליזין ליזין חוצה קישורים מטריצה קולגן של מיתרים וגיידים. חשוב לציין, 48 h של אסטרוגן גבוה (כדי לדמות את השלב follicular) ירד ליגמנט לבנות נוקשות מבלי לשנות את צפיפות הקולגן של המבנים. מנקודת מבט פיזיולוגית, הדבר מעיד על כך שהעליות ברמות הליגמנט אצל הנקבות עשויות לנבוע, לפחות בחלקן,היווצרות קישורים. מנקודת מבט ניסויית, ממצאים אלה מדגישים את התועלת של מודל בניית התלת-ממד, אשר אפשר לבחון את הפעילות המקושרת המקושרת. מנקודת מבט קלינית, מודל זה יכול לשמש כעת במהירות המסך עבור התערבויות שיכולות למנוע את ההשפעות השליליות של אסטרוגן של פונקציה ליגמנט.
הערות סיכום
כאן הצגנו מתודולוגיה מפורטת להיווצרות של מיתרים מהונדסים ואת התועלת שלהם כמו 3D במודל רקמות במבחנה . המודל מותאם מאוד למגוון רחב של מטרות, מתן גמישות בסוג התא, התערבויות, ואת מדדי התוצאה של עניין. השלמת חומרי הזנה עם סרום מותנה מוסיף הקשר פיזיולוגי כי לא ניתן להשיג בסביבה מסורתית במבחנה , שיפור הדוגמנות של פיזיולוגיה vivo . בקיצור, אנחנו מאמינים שזה מצב רלוונטיL עם השלכות מרגש עבור קידום הן בתחומי הפיזיולוגיה והנדסת רקמות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מלגה פוסט-דוקטורטית של NSERC (DWDW), מלגת קרן ARCS (AL) ומכללת UC Davis College of Biological Sciences (KB).
Materials
| Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products |
| β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors; include whether it's hazardous /toxic |
| o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors; include info on preparation |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
| Falcon 35mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
| 100X antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
| Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
| 100X penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
| Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
| DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
| Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
| Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 – 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
| CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
| Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
| BD Vacutainer Red Plastic 10 ml | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
| Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
| Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
| Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
| 6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4°C. |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
| Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20°C. |
| Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6M |
| 4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
| Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
| trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
| Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
| Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
| Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |
References
- West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
- Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise’s complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
- Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
- Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
- Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
- Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
- Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
- Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
- Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
- Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
- Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
- Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
- Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
- Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
- Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
- Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
- Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
- Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
- Woessner, J. F. The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
- Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
- Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
- Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
- Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
- Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
- Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
- Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
- Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
- Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists?. J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
- Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites (‘entheses’) in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
- Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
- Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).
