植物冰结合蛋白通过冰再结晶抑制和隔离的评估使用冰亲和力纯化鉴定
Summary
本文概述冰结合蛋白的从冷冻耐受性植物通过冰再结晶抑制活性，并使用冰 – 亲和纯化天然IBPS的随后分离的评估鉴定。
Abstract
冰 – 结合蛋白（IBPS）属于家族，其通过暴露于零下温度某些生物体合成应激诱导的蛋白质。在植物中，当胞外冰晶生长发生冷冻损伤，导致质膜和可能的细胞死亡的破裂。 IBPS吸附到冰晶通过被称为冰再结晶抑制（IRI），从而减少细胞损伤的方法限制了进一步的增长。 IBPS还证明压下平衡熔点以下的溶液，被称为热滞后（TH）活性的特性的凝固点的能力。这些防护性能都提出了小说IBPS鉴定兴趣，因为它们在工业，医疗和农业应用的潜在用途。本文描述的植物的IBPS通过1识别）IBPS的植物组织中诱导和提取，2）提取用于IRI活性的筛选，以及3）的分离和PURIFIBP的使用。在通过低温暴露诱导IBP后，使用“splat测定”测试提取物的IRI活性，其允许使用标准光学显微镜观察冰晶生长。该测定需要低蛋白质浓度并产生快速获得并容易解释的结果，为冰结合活性提供初步筛选。然后可以通过利用IBPs吸附到冰上的特性，通过称为“冰亲和纯化”的技术将IBP从污染蛋白质中分离出来。使用从植物提取物收集的细胞裂解液，可以在黄铜探针上缓慢生长冰球。这将IBP融入多晶冰的晶体结构中。不需要IBP 的先验生物化学或结构学知识，这种方法可以恢复活性蛋白质。冰纯化的蛋白质级分可用于下游应用，包括pep的鉴定通过质谱法和天然蛋白质的生化分析潮序列。
Introduction
冰-结合蛋白（IBPS）是已在许多生物包括植物1，昆虫2，鱼3，和微生物4的被发现的保护蛋白质的不同的家族。这些蛋白质的关键特征是其独特的特异且高效地吸附到冰晶，修改他们的生长的能力。 IBPS具有若干记录性质，具有两个最充分表征的是热滞后（TH）和冰再结晶抑制（IRI）。 TH活性在以冷冻不耐动物产生IBPS更容易地观察到。此活性导致有机体循环或间质液的凝固点降低，以防止冻结。相反，在冷冻耐受性生物体，这将不可避免地冻结在零度以下的温度，IBPS似乎具有低TH活性。尽管低TH活性，高的IRI活动限制冰哭飞虱生长通常与这些蛋白质观察到。对于冷冻宽容有机体，这IRI活动可能有助于保护细胞免受冰的细胞外车厢的不受控制的生长。
的“床垫键”模型可以用于描述通过该IBPS防止冰晶5的生长机制。在这种模式下，特别IBPS吸附于在时间间隔，使得水分子可以仅与结合IBPS之间的空间中生长冰晶格掺入冰晶体的表面。这就形成了一个曲率，使额外的水分子的掺入不利的，可以由吉布斯·汤姆逊效应6描述的事件。锚定笼形水域假说提供了IBPS的特异性结合到冰晶体表面上的机构，从而电荷的残基的存在，特别是定位在蛋白冰结合位点上，结果在呼肠孤水分子的rganization所以它们匹配冰晶格7的一个或多个平面。
TH活性可通过测量熔化之间的差和在IBP的存在冻结单个冰晶的温度进行定量。而TH活性评价IBPS，通过植物IBPS（通常仅一个度的一小部分）中产生的低TH间隙的活性的广泛接受的方法通常需要较高的蛋白质浓度，专门的设备和操作员的经验。虽然非IBPS可限制冰晶生长，它是由所有IBPS因此测试对于IRI活动共享的属性被用于IBPS存在一个有效的初始屏幕上，特别是对那些具有低TH活性。用于测试该活动的方法是被称为“压片分析”，由此蛋白质样品快速冷冻，以产生的小冰晶，其在一段时间，以确定是否观察到单层冰晶生长受到限制。不同于用于筛选IBPS的存在的源组织样品的其它方法，该技术适用于在10-100纳克的范围内的低的蛋白质浓度，使用容易制造的设备，并且产生快速且容易地解释的数据。然而，强调的是，该测定提供了一个初始屏幕应遵循由TH的确定和冰晶成形IBPS是重要的。
天然蛋白质的分离是具有挑战性的，通常需要关于感兴趣的蛋白质的结构和生化特性的信息。 IBPS的冰的亲和力允许使用冰作为用于纯化目的的基板这些蛋白质的分离。由于多数分子被冰晶生长，在一个高度纯化样品中的IBP样品的存在导致冰 – 半球的生长缓慢，不含大quantit期间提前冰水边界的推污染的蛋白质和溶质的IES。该方法已被用于从昆虫8，9，10，11的细菌，鱼12和植物13,14识别IBPS。此外，通过这种方法实现的IBP-富集的级分也可用于下游生化分析。本文概述IBPS在植物通过IBPS的诱导和提取的识别，IRI活性的分析，以证实蛋白质的存在，并使用冰亲和纯化的蛋白质的分离。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于IBPS成功的分析和纯化，了解一些这些蛋白质的温度敏感性是非常重要的。某些植物IBPS在温度高于0℃变得不稳定，导致解折叠，沉淀和不活动。为了获得活性IBPS，通常关键的是植物在冷室（〜4℃）处理，并在实验过程中样品保持在冰上。另一个因素考虑使用全细胞裂解物的粗时是通过内源蛋白酶的蛋白质的降解。在植物中，IBPS的表达一般是低的，并且因此在蛋白质产量的损失可能导致材料?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由NSERC（加拿大）赠款，以资助VKW。
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
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