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생화학

Préparation de vésicules encapsulant géantes Microsphères par centrifugation d'une émulsion eau-dans-huile

Published: January 24, 2017
doi:
10.3791/55282
, , , , ,
1Department of Mathematical and Physical Sciences, Faculty of Science,Japan Women’s University, 2Department of Bioorganization Research, Okazaki Institute for Integrative Bioscience,National Institutes of Natural Sciences, 3Department of Life and Coordination-Complex Molecular Science, Institute for Molecular Science,National Institutes of Natural Sciences, 4Research Center for Complex Systems Biology,The University of Tokyo

Summary

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

Abstract

La biologie constructive et l'approche synthétique de la biologie à la création de la vie artificielle impliquent l'ensemble de la base de matériaux biologiques ou non biologiques. Ces approches ont reçu une attention considérable dans la recherche sur la frontière entre la matière vivante et non vivante et ont été utilisées pour construire des cellules artificielles au cours des deux dernières décennies. En particulier, Giant Vésicules (GV) ont souvent été utilisées comme membranes cellulaires artificiels. Dans cet article, nous décrivons la préparation de microsphères encapsulant GV très emballés comme un modèle de cellules contenant des biomolécules hautement condensés. GV ont été préparées au moyen d'un procédé simple eau-dans-huile par centrifugation. En particulier, un homogénéisateur a été utilisé pour émulsionner une solution aqueuse contenant les substances à encapsuler et une huile contenant des phospholipides dissous et l'émulsion résultante a été soigneusement en couche sur la surface d'une autre solution aqueuse. Le système en couches a été ensuite centrifugé to générer les GVS. Cette puissante méthode a été utilisée pour encapsuler des matériaux allant de petites molécules à des microsphères.

Introduction

L'approche constructive, ou synthétique, la biologie est une avenue fascinante pour explorer la frontière entre vie et matière inerte. Parce que la cellule est l'unité minimale requise pour la vie comme nous l'entendons actuellement il, plusieurs chercheurs ont tenté de construire des cellules artificielles de produits chimiques simples, bien comprises afin que les phénomènes qui se produisent dans de telles cellules artificielles peuvent être étudiées, avec l'objectif ultime de élucidant les origines de la vie et l' étude des fonctions fondamentales de cellules vivantes 1, 2, 3. En particulier, les vésicules 4, qui sont des microcompartiments sphériques constituées de molécules amphiphiles et peuvent encapsuler des molécules biologiques telles que les protéines 5, 6 et 7 de l' ADN, 8, 9,lass = "xref"> 10, ont souvent été utilisés comme modèles de membranes biologiques.

Les vésicules peuvent être classés comme faible (définie comme ayant un diamètre <100 nm), de grande taille (diamètre <1 um), ou géant (diamètre> 1 um). vésicules géantes (GVS) ont été largement étudiés car ils sont semblables à des cellules vivantes dans la taille, la forme et la structure. En raison de la taille du VG, des changements morphologiques dans les membranes GV peuvent être facilement observées en temps réel sous un microscope optique.

Plusieurs méthodes de préparation ont été rapportés GVs 11, y compris le procédé d'hydratation 12, 13, le procédé de congélation-décongélation 14, le procédé de électroformation 15, 16, et le procédé de dispositif fluidique 17, 18. Cependant les protéines, et d'autres encapsulant MACROMolecules de GVS à des concentrations élevées au moyen de ces méthodes est difficile. En particulier, il est extrêmement difficile pour encapsuler des matières biologiques en quantité suffisante (20-30% en volume) pour imiter l'environnement encombré l' intérieur des cellules 19, 20. Pour former instantanément GV, Weitz et ses collègues a établi une eau-dans-huile (w / o) Méthode émulsion de centrifugation 21, 22. Cette méthode présente cinq caractéristiques importantes. Premièrement, parce que les GV préparés par ce procédé ont une faible lamellarité 23, 24, leurs membranes sont si minces qu'ils peuvent être déformés facilement. GV membrane déformation induite par FtsZ (une protéine de division cellulaire bactérienne), la tubuline, et d' autres macromolécules a été étudié 25, 26, 27, 28, et nous avons observé polyhe déformation dron comme des membranes GV induites par encapsulation des microsphères 29, 30. Deuxièmement, les protéines membranaires peuvent être insérées dans la membrane vésiculaire par ce procédé, bien qu'avec difficulté 31. Par exemple, le groupe Yomo a utilisé cette méthode pour étudier la synthèse in vitro et l' activité de formation de pores de la protéine membranaire α-hémolysine 32. Troisièmement, il est possible de générer GVs asymétriques dans lesquels les constituants lipidiques des valves internes et externes sont différents 22. Par exemple, Whittenton et al. GV asymétriques générées avec des lipides cationiques dans le feuillet interne pour encapsuler des polynucleotides chargés négativement, et avec des lipides neutres sur le feuillet externe pour diminuer la toxicité et l' absorption cellulaire non spécifique 33. Quatrièmement, la fraction de la concentration et le volume de substances à l'intérieur des GV peut être relativement élevés = "xref"> 28, 34. En cinquième lieu , plusieurs types de matériaux peuvent être encapsulées 35. Par exemple, Nishimura et al. encapsulé un système de transcription-traduction in vitro dans VG et utilisé le système pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) dans le GV 36. Ces cinq caractéristiques font émulsion w / o centrifugation une méthode indispensable pour générer GVs mimant les cellules.

Dans des travaux antérieurs, GV générés par centrifugation ont été recueillies au moyen d'une seringue munie d'une 16 G aiguille en acier inoxydable longue contenant une partie de la solution aqueuse finale 22. Dans les mains des techniciens inexpérimentés, cette méthode de collecte pourrait facilement entraîner la contamination du GV avec de l'huile. Dans cette étude, nous avons utilisé le w / o protocole émulsion de centrifugation développée par le groupe Yomo 23, 37,dans lequel GVs précipités sont recueillis par un trou ouvert au fond du tube de centrifugeuse dans lequel ils sont préparés. Nous avons préparé GV encapsulant 1,0 um microsphères, qui sont similaires en taille aux organites intracellulaires. L'utilisation de microsphères nous a permis d'estimer leur concentration en calculant leur fraction volumique. Mise en place d'une méthode pour la préparation de GV dans lequel les matériaux sont denses est une étape importante pour la création de cellules artificielles. Pour confirmer l'utilité de notre protocole pour différents types de matériaux intérieurs, nous avons aussi démontré que la GFP et soluble dans l'eau à petite molécule fluorescente (uranine) peuvent être encapsulés dans les GVS.

Protocol

1. Préparation de la GV par émulsion E / H Centrifugation Méthode Préparer une solution mère de 1,2-dioleoyl- sn – glycéro-3-phosphocholine (DOPC, 25 mM) et une solution mère de Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- sn – glycéro-3-phosphoéthanolamine, sel de triéthylammonium (Texas Red DHPE, 0,20 mM) dans du chloroforme et de stocker les solutions mères à -20 ° C. Préparer une solution huileuse. Former un film lipidique sur la surface intérieure d'un flacon de 5 ml de verre par évaporation d'un mélange de la solution DOPC de stock (51,0 pi et le stock solution Texas Red DHPE (19,2 pi) sous un courant d'azote gazeux. Incuber le film sous une pression réduite pendant une nuit, puis ajouter 1,0 ml d'huile de paraffine (0,86 à 0,89 g / cm3) au flacon. Envelopper le flacon dans une feuille d'aluminium et incuber à 80 ° CO / N au repos. Les concentrations finales de DOPC et le Texas Red DHPE sont respectivement de 1,3 et 3,8 x 10-3 mM, Respectivement, et le DOPC rapport molaire Texas Red DHPE est de 100: 0,3. Préparer la dispersion aqueuse interne. Dans un 1,5 ml microtube lidded, mélanger 237,5 pi d'une dispersion de 1,0 um microsphères non fluorescentes (2,5 vol%) et 12,5 pi d'une dispersion de 1,0 um microsphères fluorescentes (2,5 vol de%); ceci correspond à un rapport 95: 5 (v / v) rapport de non fluorescent à des microsphères fluorescentes. Ajouter 64 mg de saccharose suivie par 125 pi de solution tamponnée au Tris (TBS, 1 M) et 875 pi d'eau déminéralisée. La fraction volumique finale des microsphères est de 0,5% en volume et les concentrations finales de Tris-HCl (pH 7,5) et de saccharose sont de 0,1 et 0,15 M, respectivement. Vortex microtube pendant 30 secondes, puis sonication pendant 10 min. Préparer la solution aqueuse externe. Après une préparation de 10 ml d'une solution tampon Tris (0,1 M de Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M glucOSE) dans la même procédure que les milieux aqueux intérieur, placer 1 ml de la solution dans un microtube de 1,5 ml à couvercle. Vortex microtube pendant 30 secondes, puis sonication pendant 10 min. Préparer émulsion eau / huile contenant des microsphères. Mélanger 1 ml de la solution d'huile (paraffine liquide contenant du DOPC et le Texas Red DHPE) avec 300 ul de la solution aqueuse interne dans un microtube de 1,5 ml. Émulsifier les deux composants du micro-tube à l'aide d'un homogénéiseur mécanique (un agitateur à pales qui tournent à grande vitesse) fonctionnant à 10 000 tours par minute pendant 2 minutes à température ambiante. Précipiter les GVS. couche doucement 300 ul du émulsion w / o sur la surface supérieure de 1 ml de la solution aqueuse externe à 4 ° C dans un microtube de 1,5 ml à couvercle. Refroidir le microtube pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir les GVS. Immédiatement après le refroidissement du micro-tube,centrifuger à 18 000 x g pendant 30 min. Obtenir les précipités GVs en perçant le fond du microtube avec une barrette à ressort et à recueillir une goutte dans 1,5 ml stérilisé microtube. Diluer le GV précipité gouttelette 10-100 fois en volume avec la solution aqueuse externe si les GV obtenus sont obtenus en quantité suffisante pour rendre l'observation difficile. 2. Microscopie Observation de GV Préparer l' échantillon de microscopie. Placer une chambre d'incubation adhésif pour réaction in situ en chaîne par polymérase et l' hybridation (taille de la chambre 9 mm x 9 mm x 0,3 mm d' épaisseur) sur une lamelle couvre -objet de microscope. En utilisant une micropipette, dépôt de 25 ul de la dilution précipité GV sur la zone de l'échantillon et placer immédiatement un autre verre de couverture (environ 0,15 mm d'épaisseur) sur le dessus de la chambre d'incubation. Enregistrez contras d'interférence différentielimages de microscopie t des GVS. images de microscopie d'enregistrement des vésicules avec un microscope (10X, 20X et 40X objectifs) équipé d'une lampe halogène 12V100WHAL-L. Effectuer des observations de microscopie de fluorescence. Insérez U-FBNA et U-FMCHE unités miroir de fluorescence dans le microscope. Monter les unités avec 470-495 nm et 565-585 nm excitation filtres, respectivement, et avec des filtres d'émission qui transmettent respectivement 510-550 nm et 600-690 nm lumière.

Representative Results

Le procédé centrifugation émulsion w / o est illustrée photographiquement et schématiquement sur la figure 1. L'image schématique de la figure 1 indique que le facteur le plus important de la réussite de ce procédé est que la gravité spécifique de la solution aqueuse interne doit être supérieure à celle de la solution aqueuse externe, de sorte que les GV précipitent pendant la centrifugation. En outre, la formation d'une monocouche lipidique à l'interface p / o exige que le système soit refroidi pendant 10 minutes après que l'émulsion est stratifiée sur la solution aqueuse externe. Étant donné que la forme GVs par le transfert de gouttelettes de l'émulsion à travers l'interface w / o, les pressions osmotiques dans les phases aqueuses interne et externe doivent être les mêmes. Comme une expérience de contrôle, nous aussi préparés GV ne contenant pas de microsphères au moyen du procédé représenté sur la figure 1 et l' étape 1.3, sauf que la solution aqueuse interne étaitpréparé sans microsphères. La collecte des précipités GVs après centrifugation est représentée sur la figure 2. En plus de la phase semi – transparente au bas du microtube, nous avons également observé une phase intermédiaire turbide blanche dans la solution aqueuse externe (figure 2a). Cette phase intermédiaire a été riche en agrégations de microsphères et de l'huile, alors que la phase inférieure contenait les GVS. Par conséquent, après avoir percé le fond du microtube avec un pushpin (Figure 2b), nous avons recueilli seulement la première goutte (figure 2c), qui contenait des quantités massives de GVS. Il est important de veiller à ce que pas plus de deux gouttes sont recueillies; les gouttes supplémentaires peuvent contenir des agrégations de microsphères et de lipides, ce qui se traduira par une plus faible densité de GVS. La dispersion vésiculaire obtenue contient souvent des matériaux encapsulés en dehors des GV parce que les GV Often rupture pendant la centrifugation. Pour obtenir seulement GVs, un procédé de tri tel que la dialyse, la filtration sur gel, ou d'une cellule tri activé par fluorescence doit être choisie, en raison des dimensions des matériaux d'encapsulation. Si nécessaire, dans le but pour lequel les précipités sont GVs être utilisés, ils peuvent être dilués avec de la solution aqueuse externe. Dans certains cas, la phase intermédiaire prolongé jusqu'au fond du tube, ce qui suggère que les vésicules qui se sont formées ont été maintenues ensemble par l'huile. Nous avons obtenu des images différentielles de microscopie d'interférence et microscopie par fluorescence des microsphères sans GVs (figure 3a, 3b) et avec des microsphères (figure 3 c -3 f). Conformément aux rapports précédents 23, 37, GV à faible lamellarité ont été formés par notre protocole. Lipids conjugués avec Texas Red DHPE, qui émet fluores rougecence, ont été utilisés de telle sorte que la formation de vésicules pourrait être directement confirmée par la visualisation de la membrane mince. Sur les 160 GV que nous avons obtenus, 55 microsphères encapsulées et 105 étaient vides, donnant un rapport d'encapsulation de 34%. Nous avons déterminé la fraction volumique (φ,% en volume) de microsphères dans les GV au moyen du procédé suivant. Du fait que chaque GV contient des dizaines à plusieurs centaines de microsphères, en comptant tous les microsphères en microscopie optique est difficile. Par conséquent, nous avons mélangé les microsphères non fluorescentes de 1,0 pm avec une petite quantité de microsphères fluorescentes, qui ont été comptées manuellement au microscope à fluorescence. Le nombre total (N) de microsphères encapsulées a été calculé en multipliant le nombre (n) de microsphères fluorescentes comptées manuellement par 20 (basé sur l'original 95: 5 [v / v] rapport de nonfluorescent à des microsphères fluorescentes). La valeur de66; a ensuite été estimée à 100 Nv / V, où V est le volume des microsphères et V est le volume de la GV individuelle. Notez que l' estimation de N à partir de n donne lieu à des erreurs de comptage, et ces erreurs doivent être pris en compte lors du calcul de φ. La valeur de φ a été estimée à partir de N, qui a été directement calculé comme 20 n, ce qui à son tour conduit à la probabilité que & phiv représente avec précision la valeur réelle est <50%. En fait, N varie dans une certaine mesure environ 20 n, nous avons donc besoin de le considérer comme 20 (n ± i), où i est l'erreur n. Nous i estimé pour qu'une probabilité de n ± i pourrait être plus de 50% obtenu sur la base d'une distribution de Poisson. Nous i estimé, ce qui nous a permis de calculer 20 (n ± i) et les valeurs de66; qui comportait des erreurs de comptage pour GVs avec des diamètres de 10 et 15 um (tableau 1). Selon cette procédure, la fraction volumique des microsphères dans le GV représentés sur la figure 3c a été estimée à 11 ± 3% en volume. La précision de la fraction volumique calculée était de 10-30%. Nos résultats indiquent que nous encapsulé avec succès 1 um microsphères de GVS à une fraction de volume élevé. Nous avons également réussi à encapsuler d' autres matériaux dans 100% en moles DOPC VG en utilisant la même solution aqueuse externe et le même protocole (figure 4). Plus précisément, les GV contenant 0,1 um microsphères ont été préparées à partir d'une solution tamponnée au Tris contenant 0,1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M de saccharose et 0,5% en volume de microsphères fluorescentes au moyen du protocole décrit pour GV contenant des microsphères de 1,0 um ( La figure 4a). Suivant le protocole décrit above DOPC GV contenant de la GFP (0,1 M de Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M de saccharose et 100 pg / ml GFP; 4b figure) et GV contenant uranine (0,1 M de Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M de saccharose, et 30 uM uranine; Figure 4c) ont également été préparés. n N φ (10 um de diamètre) φ (15 um de diamètre) 3 60 ± 20 6,0 ± 2,0 1,8 ± 0,6 4 80 ± 20 8,0 ± 2,0 2,4 ± 0,6 5 100 ± 20 10 ± 2 3,0 ± 0,6 6 120 ± 30 12 ± 4 3,6 ± 1,2 dix 200 ± 32 20 ± 3 5.9 ± 0,9 20 400 ± 45 40 ± 5 12 ± 2 30 600 ± 55 – 18 ± 2 un erreurs ont été déterminées comme décrit dans le texte; n = nombre de microsphères comptés manuellement; N = nombre total de microsphères encapsulées. Tableau 1: Chiffres et volume Fractions (φ, vol%) des microsphères a. un erreurs ont été déterminées comme décrit dans le texte; n = nombre de microsphères comptés manuellement; N = nombre total de microsphères encapsulées. Figure 1: Flow Ch art et schématique Représentation de W / O Emulsion Centrifugation Méthode. (A) une solution d'huile consistant en DOPC et le Texas Red DHPE (ratio de 100: 0,3 molaire) dans de la paraffine liquide. (B) la dispersion aqueuse interne consistant en le saccharose et des microsphères dans du tampon Tris-HCl. (C) une solution aqueuse externe consistant en le glucose dans un tampon Tris-HCl. (D) mélange de 1 ml d' une solution d'huile et de 300 ul d' une dispersion aqueuse interne. (E) L' émulsification avec un homogénéisateur (10 000 tours par minute, 2 minutes). (F) l'émulsion w / o. (G) Superposition de 300 pl de l'émulsion sur 1 ml de la solution aqueuse externe. (H) Précipité GV juste après centrifugation. (I) Représentation schématique du principe de la méthode de centrifugation émulsion w / o. La flèche noire indique la direction de l'accélération centrifuge..jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Piercing du Microtube. (A) Précipité GV juste après centrifugation (également représenté sur la figure 1h). L'ellipse rouge indique la gouttelette de la dispersion GV précipité. (B) Piercing du microtube avec une punaise. Le culot contenant le VG a été obtenue en perçant le micro-tube à proximité du fond avec une barrette à ressort et en recueillant des gouttelettes à partir du trou. (C) Droplet des GV précipités (indiqué par la flèche jaune) dispersion diluée avec la solution aqueuse externe. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figure 3: Images Microscopie de GVS. (A) image de microscopie de contraste d'interférence différentielle d'un GV sans microsphères. Le diamètre de la GV est d'environ 10 um. Barre d'échelle = 10 pm. Image de microscopie (b) de la fluorescence d'une GV sans microsphères. La fluorescence rouge a été émise par le Texas Red DHPE. (C) image de microscopie différentiel de contraste d'interférence d'un GV contenant des microsphères. (D) Fluorescence microscopie image de 1,0 um (microsphères de microsphères YG carboxylates) à l' intérieur d' un GV. Le nombre de microsphères fluorescentes comptées (n) était 6. Nous avons estimé les erreurs (i = 2) sur la base de la distribution de Poisson. Ensuite , nous avons estimé le nombre total de microsphères internes (N = 20 (n ± i)) était de 120 ± 40. On a calculé que laGV contenait 1,0 pm microsphères à une fraction volumique (φ = 100 Nv / V) d'environ 11 ± 3% en volume, où v est le volume des microsphères et V est le volume des GVS. (E) la microscopie de fluorescence image d'une membrane GV. La fluorescence rouge a été émise par le Texas Red DHPE. (F) l' image des images dans les panneaux d et e Fusionné. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: contraste d' interférence différentiel et Fluorescence Microscopy Images de GV avec différents matériaux encapsulés. microscopie différentiel de contraste d'interférence (en haut) et la microscopie à fluorescence (en bas) des images deGV contenant (a) de 0,1 um microsphères, (b) GFP, et (c) uranine. Les barres d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les gravités spécifiques du milieu de dispersion aqueux interne et externe de la solution aqueuse doit être choisie avec soin. Pour l'émulsion w / o à précipiter dans la solution aqueuse externe au cours de la centrifugation, la densité du milieu aqueux de dispersion interne doit être supérieure à celle de la solution aqueuse externe. Nous avons essayé de préparer GV en utilisant des solutions internes et externes sans sucres, mais nous avons obtenu aucun GV dans ces conditions, parce que la solution aqueuse interne n'a pas eu assez de masse pour traverser l'interférence entre les deux phases. S'il y a une grande différence de pression osmotique entre les deux solutions, GV qui précipitent dans la solution aqueuse externe peut rétrécir ou rupture. Par conséquent, la pression osmotique à l'intérieur et à l'extérieur des GV doivent être égaux. Pour ce faire, nous avons utilisé le saccharose comme soluté dans la dispersion aqueuse interne et du glucose en tant que soluté dans la solution aqueuse externe; les deux sucres étaient présents à la même concentration. Les deux selss = "xref"> 22 et de sucre 23, 35, 38 ont été utilisées à de telles fins, mais le sucre est habituellement utilisé parce qu'il est moins toxique et plus soluble que le sel. Cependant, si trop de sucre est ajouté, les GV peuvent entrer en contact avec le fond du verre de couverture et de l'effondrement. Il existe plusieurs stratégies pour éviter ceci. Une stratégie consiste à réduire la différence de gravité spécifique entre les solutions aqueuses interne et externe de sorte que les GVs précipitent dans des conditions douces; Plus précisément, le surnageant de la dispersion GV précipité peut être échangée avec une solution identique à la solution aqueuse interne afin de réduire la possibilité de rupture vésiculaire par adhérence à la vitre de protection en raison de la flottabilité. Une autre stratégie consiste à revêtir préalablement les deux verres de couverture avec un mince film de lipide 29.

Une préparation appropriée et l'incubation de l'émulsionimportant. On a utilisé la paraffine liquide pour préparer la solution d'huile. Huile 26, 31, dodécane 21, 33 et squalane 33 minéraux, 39 sont également souvent utilisés comme huiles de solvant. Du fait que ces matériaux varient en masse volumique, la viscosité et la tension superficielle, des nombres différents de vésicules se forment même lorsque les mêmes conditions de centrifugation , on utilise 33. Pour obtenir des vésicules ayant les propriétés cibles, il est essentiel d'optimiser les densités et viscosités des solutions aqueuses interne et externe spécifiques ainsi que la préparation acceleration.For centrifuge de la phase huileuse, l'incubation doit avoir lieu à température élevée et dans un endroit sec environnement, comme un incubateur ou un déshydrateur. Dans cette étude, nous avons chauffé la paraffine liquide à 80 ° C pour dissoudre complètement le lipide molecules.In outre, l'émulsion devraitêtre préparé qu'en cas de besoin et doit être immédiatement soumis à une centrifugation, car il est instable juste après sa préparation et w / o gouttelettes fusionnent facilement les unes aux autres. L'émulsion peut être préparée en grandes quantités par sonication, tourbillonnement, ou les écoutes. Cependant, l'utilisation d'un homogénéisateur permet la préparation rapide de grandes quantités d'émulsion et de faciliter l'émulsification dans l'huile avec une viscosité élevée. Il est également important que l'émulsion soit stratifiée sur la solution aqueuse externe en douceur et rapidement, puis refroidi à 4 ° C. Pour raccourcir le temps entre l'émulsification et la centrifugation, le système de solution aqueuse d'huile externe peut être prérefroidi avant que l'émulsion est stratifiée sur elle, et l'ensemble du système peut ensuite être centrifugé immediately.If le trouble blanc apparaît plus rapidement ou plus lentement que d'habitude, la mécanique homogénéisateur doit être soigneusement rincé pour éliminer les détergents de nettoyage. En outre, avant émulsification, la solution d'huile, d'une solution aqueuse interne, et d'émulsifiant doit être returned à la température ambiante.

accélération centrifuge appropriée est également importante. Par centrifugation à 18.000 x g, nous avons été en mesure de préparer GV avec un seul matériau intérieur encapsulé à une concentration élevée. Lors de l'encapsulation de matériaux multiples est nécessaire, il est préférable de réduire l'accélération centrifuge. Par exemple, un système d'assemblage d'actine sept composés d' encapsulation a été réalisé avec une centrifugation à au moins 350 x g 35. Dans les cas dans lesquels la centrifugation est indésirable, GVs peut être obtenue en ajustant la concentration en sucre ou en précipitant l'émulsion sous l'influence de sa propre masse 38, 40, 41.

La méthode décrite ici présente deux limites importantes. L'une est que les molécules d'huile (de la paraffine, dans ce cas) peut être solubilisés dans la membrane GV, comme cela a été souligné par le Weitz groupe 21. Lors de l'insertion d'une protéine de membrane dans la membrane GV est souhaitée, les effets des molécules d'huile coexistantes sur la protéine doivent être considérées. L'autre limite est la variation de la fraction volumique. Dans cette étude, nous avons estimé que les fractions de volume de microsphères dans les GV variaient 4-30% en volume; les fractions de volume ne sont pas identiques à la fraction volumique de la solution aqueuse interne utilisée pour la préparation GV. Bien que nous étions capables d'encapsuler des microsphères dans des GV pour une fraction volumique suffisamment élevée pour que l'observation au microscope, cette méthode ne convient pas pour la préparation de VG avec une distribution de la fraction volumique uniforme. Il a été rapporté que la distribution des fractions de volume de microsphères change lors de la centrifugation 34.

Le procédé de centrifugation émulsion w / o est couramment utilisé pour la formation de GV contenant des matières encapsulées. Cependant, peu de rapports ont décrit la préparation des GV encapsulant matériaux micrométriques 34, 42. Récemment, des robots moléculaires contenant un dispositif d'ADN encapsulé ou un dispositif moléculaire ont été construits 43, 44. GV avec compartiments sont le premier choix pour ces types d'applications; Par conséquent, les techniques, comme la nôtre, qui pourraient être utilisées pour encapsuler des microsphères magnétiques et des microsphères avec diverses fonctionnalisation de surface peuvent être censés être utiles 44.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Tomoko Yamaguchi pour dessiner l'image schéma de la figure 1. Cette étude a été soutenue par le projet Okazaki ORION de l'Institut Okazaki for Integrative Bioscience des theNational Instituts des Sciences naturelles (NINS); par le Projet Centre Astrobiology (pas AB281010.) de NINS; par un Grant-in-Aid pour la recherche scientifique sur les zones innovantes (de commande dynamique des systèmes biomoléculaires pour la création de fonctions intégrées) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (pas 25.102.008.); par un Grant-in-Aid pour jeunes scientifiques (B) (à KK, pas 15K17850.) à partir de JSPS; etpar un Grant-in-Aid pour la recherche Activité Start-Up (à YN,. 15H06653 pas) à partir de JSPS. Un soutien supplémentaire a été fourni par une subvention de l'Institut Noguchi, une subvention de la Fondation Kao des Arts et des Sciences, et une subvention de l'eau Kurita Fondation Environnement.

Materials

REAGENTS:
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375C Vesicular membrane molecule
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) Thermo Fisher Scientific T1395MP
Liquid paraffin Wako Pure Chemical Industries 128-04375 Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL
1 M Tris-HCl (pH 7.5) Nippon Gene Co. 318-90225 Buffer solution
D(+)-Glucose Wako Pure Chemical Industries 049-31165 For outer water solution
Sucrose Wako Pure Chemical Industries 196-00015 For inner water solution
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm Polysciences 08226-15 Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm Polysciences 15702-10 Fluorescent, 2R = 1.0 µm
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm Polysciences 16662-10 Fluorescent, 2R = 0.10 µm
Fluorescein sodium salt (uranine) Sigma Aldrich Japan F6377-100G
GFP standard (recombinant) Vector Laboratories MB-0752
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT:
Centrifuge 5427R Eppendorf  5409000233 Centrifuge rotor: FA-45-48-11
Physcotron Microtec Co. NS-310EIII Handy micro-homogenizer
Generator shaft Microtec Co. NS-4 Homogenizer attachment
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization Bio-Rad Laboratories SLF0201 Hybridization chamber volume: 25 µL
Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization Bio-Rad Laboratories SLF0601 Hybridization chamber volume: 65 µL          
Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm
Microman E Gilson FD10006 Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this.
Inverted microscope Olympus Co. IX73
Mirror unit Olympus Co. U-FBNA Excitation filter: 470-495 nm
Emission filter: 510-550 nm
Mirror unit Olympus Co. U-FMCHE Excitation filter: 565–585 nm
Emission filter: 600-690 nm
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References

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Natsume, Y., Wen, H., Zhu, T., Itoh, K., Sheng, L., Kurihara, K. Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion. J. Vis. Exp. (119), e55282, doi:10.3791/55282 (2017).
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