示差走査熱量測定 - タンパク質抗原の熱安定性および立体配座を評価するための方法

熱量計は、実際に試料溶液、バッファ35への熱流量の差を測定するように、ほとんどのDSC実験からの生データは、温度グラフに対する熱流束として提示されます。両方の細胞（ すなわち 、サンプルとリファレンスセル）が実験中に同一のソリューションが含まれている場合そのため、スキャンからの生データは、観察されないピークが平坦な線でなければなりません。観察された任意のピークはなぜ分析をサンプリングする前にバッファのスキャンを実行している計装エラー（ 例えば 、損傷または汚染された細胞）に帰することができる適切なシステム適合性試験です。 図1は、熱量計分析をサンプリングする前に良好な作動状態にあったことを示す典型的なバッファスキャンの結果を示しています。 図2は、DSC実験の生データは差分に行っ示しています2つのタンパク質試料のerentたくさん。以前に示唆されるように、観察されたピークは、サンプルと、それぞれのバッファの熱流束の差があります。サンプル濃度の差は、熱量計によって記録された熱容量の変化を引き起こす可能性があります。しかし、これらの変化は、手順のセクション4.2に従ってサンプル分析の間に正規化されます。より高い濃度は、より低い濃度での遷移に寄与しない付加的な熱力学的ドメインを明らかにすることができます。また、各遷移は、タンパク質36の一つ以上の構造ドメインを含むことができる熱力学的ドメインを表します。この場合には、タンパク質1は、協働して溶融3つの構造ドメインを有します。 図3は、ベースライン減算および反復曲線Fiの後、タンパク質1及び図2に示す2、 すなわちのための生データの分析から生成された結果を示していますめの設定。得られたサーモグラムは、レート（自動解析ソフトウェアで予め設定されたアルゴリズムによって行わ）及び濃度を走査するための正規化されています。このように、温度グラフ対同等熱容量の実験の結果を提示します。解析ソフトウェアは、タンパク質のアンフォールディングの協同に応じて上に与えられた方程式のバリエーションを使用して他の熱力学的パラメータを導出するために、このようなT mとΔCPとして温度グラフ、対熱容量からのデータを使用しています。 未知のサンプルをテストする場合、適切な温度範囲を設定することは非常に重要です。そうでなければ、不完全なサーモグラムを図4に示すように、生じ得ます。このようなプロファイルのT mを導出することができるが、ΔHを正確に決定することができません。したがって、サンプルは完全に熱転移をキャプチャするために広い温度範囲で再テストする必要があります。いくつかのタンパク質はまた、再adilyフォームが増加移行後の熱容量で、その結果、完全な変性の後に集約します。 図2（b）に示すように 、これは多くの場合、不完全なサーモとして表示されます。しかし、より高い最終温度でテストすることをそこにサーモのその領域における構造遷移の発生であるか、それは、タンパク質凝集体の単なる熱吸収効果であるかどうかを確認することができます。 熱安定性は、業界37におけるタンパク質およびタンパク質ベースの製品の最も重要な物性の一つです。医薬品には、処方緩衝液や、湿度や温度などの環境要因を含む様々な条件下で生物製剤の安定性を決定するために使用されます。また、生産ロット間のコンホメーションの一貫性を確保するために、主要な製造工程（ 例えば、精製および解毒）を監視するために使用されます。 <strong >図5及び図6は、2つの異なるタンパク質の安定性および構造的立体配座にそれぞれの化学的解毒および保管条件の影響を調べるために、DSCの使用を示しています。 TmとΔHに有意差はそれぞれ、コンフォメーション変化およびタンパク質分解を示しています。また、 図6の第三の遷移損失はさらにサンプルが（多角度光散乱（SEC-MALS）によるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した場合、分子量の減少により確認されたドメインの分解を示しますデータ示さず）。 図1：バッファをスキャンします。観察されないピークを持つ各スキャンの勾配の類似性は、楽器が良好な作動状態にあり、再現可能な結果を​​生成したことを示します。//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2：DSC実験から収集された生データ。これらのグラフは、（ すなわち、ベースラインの前の減算とカーブフィッティングに）実験ラン以降に取得した未解析（生）データの良い表現です。各行は製造ロットを表します。タンパク質2は、サーモのポスト遷移領域における100℃以上の熱容量の増加、その結果、加熱時より容易に凝集する傾向があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <br/> 図3：DSCデータ分析。これらのグラフは、（ すなわち 、ベースライン減算し、カーブフィッティング後の）分析DSCデータの良好な表現です。赤い線は、サーモにベストフィットの曲線を表す青い線は、ベースラインを引いた後のサーモグラムを表します。タンパク質1サンプル＃12（A） の T mおよびΔHは、それぞれ80.16℃、1.69×10 6カロリー/モルです。 （B）タンパク質1サンプル＃13のT mおよびΔHは80.15℃であり、それぞれ1.71×10 6カロリー/モルです。 （C）タンパク質2サンプル＃21のT mおよびΔHは75.01℃であり、それぞれ4.08×10 6カロリー/モルです。タンパク質2サンプル＃22のために（D）T mとΔHはそれぞれ75.67℃、4.22×10 6カロリー/モルです。 にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。 図4：不完全なサーモ。生データは不十分な温度範囲で分析タンパク質1のために収集します。実験の最終温度は120℃に設定した図2Aのための実験と比較して、タンパク質の全体の遷移プロファイルに対応しなかった90°Cに設定しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図5：データはプロテイン1（A）の立体構造上の化学解毒の効果を示す分析タンパク質1は、その天然のコンフォメーションとヘクタールで毒素でありますそのT mは 2.57×10 5カロリー/モルで56.84℃、ΔHでね。 （B）タンパク質1（ すなわちトキソイド）の無毒化された形は、それぞれの T mと81.01°CのΔH値および1.89×10 6カロリー/モルを持っています。したがって、解毒ステップは、その無毒化形式に大きな安定性（より高いT m）を付与するタンパク質1の構造の立体配座に変化のいくつかのフォームを導入することを結論付けることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図6：これらのグラフは、保存温度の影響を示すデータは、タンパク質3の立体構造上の保存条件の影響を示す分析 （2から8℃）での安定性とProの三次構造に3 30週間以上TEIN。ストレージの8 番目の （A）及び38週目 （B）におけるタンパク質3のT m及びΔHの値を以下の表1に示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 サンプル Tmの1（°C） ΔH1（CAL /モル） Tmの2（°C） ΔH2（CAL /モル） Tmの3（°C） ΔH3（CAL /モル） 8週間、2-8℃で保存されたタンパク質3 61.91 1.71×10 5 75.54 2.17×10 5 90.29 4.17×10 5 <t38週間、2-8℃で保存されたD>タンパク質3 61.87 1.66×10 5 75.18 1.46×10 5 90.22 5.76×10 5 表1：2でのストレージの8 番目と38 番目の週でタンパク質3のTm及びΔH値- 8℃。両方の時点でT m値が類似しているが、ΔH値の差は、タンパク質3の三次構造は、指定された保存条件の下で30週間にわたって低下したことを示しています。