Гидравлический экструзионный спинного мозга и выделение спинальных ганглиях в Грызуны

Все животные были обработаны в полном соответствии с датскими и европейскими нормами. Номер Разрешение: 2012-15-2934. 1. Подготовка Шприц для гидравлического Extrusion спинного мозга Для взрослых крыс, используют шприц объемом 10 мл. Для взрослой мыши, используйте 5 мл шприц. Для щенят, используйте 2,5 мл шприц. Отрегулируйте пипетку без фильтра универсально пригодного для 2-200 мкл пипеток путем обрезки большой конец наконечника пипетки, пока он не подходит плотно к шприцу. Поместите скорректированный наконечник на шприц. Для щенят, используйте 23 G или аналогичную иглу вместо скорректированной наконечника пипетки. Отберите ледяной стерильной PBS и оставьте шприц на льду до дальнейшего использования. 2. Эвтаназия Не выполнять шейки дислокации, так как это будет мешать спинных позвонков рендеринга экструзию невозможно. Для взрослых крыс / мышь, эвтаназии с использованием газа , такого как CO 2 или isofluRane. Эти вещества являются вредными. Выполните эвтаназию в вытяжном шкафу и обрабатывать вещества в соответствии с директивами учреждения. (ВНИМАНИЕ: CO 2: H280, P410, P403, изофлуран: H361d, P260, P281, P280) Для того, чтобы гарантировать, что грызун умер, обеспечить отсутствие рефлекса, зажимая лапой с помощью пинцета. Обезглавьте грызуна с помощью больших ножниц. Для щенят, эвтаназии путем декапитации. 3. Выделение позвоночнике Разбрызгивали воду на шерсть, чтобы контролировать волосы. Используя пару ножниц, разрезать шерсть вдоль позвоночника в дистальном направлении и изолировать позвоночника путем разрезания с обеих сторон вдоль позвоночника мимо тазовой кости. Отрежьте спинной мозг дистально к тазовой кости с парой ножниц. Примечание: Ростральный-каудальном ось обозначена как проксимальной-дистальной оси на протяжении всего протокола. Обрежьте позвоночника с помощью пары ножниц, чтобы избежать proximal-наиболее и дистальных большинстве районов, поскольку они могут оказать позвоночник слишком S-образную форму для успешного спинного мозга экструзии. Убедитесь, что спинной мозг имеет на обоих концах. Если спинной мозг не видно, обрезать позвоночника с ножницами, пока спинной мозг не станет видимым. 4. Гидравлический экструзионный спинного мозга Поместите чашку Петри (100 мм в диаметре), заполненной стерильным PBS на льду. Выпрямите позвоночник, применяя указательный палец на изогнутой части (проксимального наиболее конец) позвоночника, тем самым выпрямление позвоночника в максимально возможной степени. Для щенят, избежать изгиба позвоночника, а позвонки будет нарушена рендеринг спинного мозга экструзию невозможно. Вставьте наконечник (23 G иглы для щенков, в качестве альтернативы 18 G иглы для взрослых мышей) на дистальных большинстве конце позвоночника. Если вставлена ​​правильно, кончик стабилизируется в спинном полости. Убедитесь, что позвоночник распрямляется, насколько это возможно. Применить постоянное давление, и прессовать спинного мозга в чашку Петри на льду. Убедитесь в том, что спинной мозг находиться во влажном состоянии на льду не держа его в PBS до дальнейшей обработки. Рисунок 1: Типичные спинного мозга. Гидравлически выдавливается спинного мозга. Слева направо: взрослой крысы, взрослой мыши, мыши щенка. Поясничные утолщения отмечен коробкой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 5. Определение спинальных ганглиях (DRGs) Разделить позвоночника в двух одинаковых продольных частей с помощью ножниц и место раздвоение позвоночника под микроскопом. Определить сегмент T13 позвонка путем местонахождение места прикрепления дистального-наиболее ребрышками на позвоночнике обращая внимание, чтобы не путать с ребрышками близлежащих межреберных нервов. Дистальные-большинство ребрышки прикреплены к проксимальной части сегмента позвонка Т13 и Т13 КСГ расположен дистально к позвонка Т13 и проксимально к позвонка L1. Определить сопутствующую ДРГ в дистальном направлении. Для взрослой крысы, сопутствующее DRGs появляются белые с четко видимой спинных и брюшных корней. Для взрослой мыши, сопутствующее DRGs появляются белые с четко видимой спинных и брюшных корней. Для щенят, сопутствующее DRGs появляются как четкие сферы. Рисунок 2: Определение ДРГ в позвоночнике после экструзии спинного мозга. Позвоночник была разделена позволяет визуализировать КСГ, как показано стрелками. ПРИМЕРЕ взрослой крысы и мыши детеныша. исх = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 6. Выделение КСГ Блюда Количество Петри (диаметром 30 мм) в соответствии с конкретными КСГ быть изолированы, например , L3, L4, L5. Заполните чашки Петри с ледяной стерильной PBS и поместите их на лед. Использование микро-ножницы, вырезать спинной и брюшной корни как можно ближе к КСГ, как это возможно, чтобы освободить их, избегая при этом повреждения ДРГ. С помощью кончика закрытых пинцетом, аккуратно выкопайте ДРГ и передавать их в соответствующие пронумерованные чашки Петри. Рисунок 3: Представитель изолированных ДРГ. Слева направо: взрослой крысы, взрослой мыши, мыши щенка."_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 7. Обработка тканей для дальнейшего анализа Вестерн-блоттинга Изолировать область ткани интерес, например , спинного мозга расширения поясничного отдела. При необходимости отделить спинной мозг в ипсилатеральных и контралатеральной стороны и далее в спинных и брюшных рога. Поместите ткань в буфере для лизиса , таких как TNE буфера для лизиса (10 мМ Трис-основание, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40 в бидистиллированной H 2 O) , содержащий соответствующие ингибиторы фермента на льду. Однородный ткани в течение примерно 30 секунд на льду с помощью механического измельчения пестик. Центрифуга в течение 15 мин при 16000 х г при 4 ° С и используют надосадочную жидкость для дальнейшей обработки в соответствии со стандартными протоколами 5, 6 или держать супернатант при -20 ° С до дальнейшего использования. РНК-анализ Изолировать интересующей ткани. Сразу же место ткани в период стабилизации РНК растворе для стабилизации РНК для хранения. Изолировать РНК в соответствии со стандартными протоколами 7. Преобразование РНК в кДНК и выполнять КПЦР в соответствии со стандартными протоколами 7. иммуногистохимия Для свежезамороженной ткани (применительно к спинному мозгу): Готовят из сухого льда порошок измельчением сухих кубиков льда в количестве, соответствующем двум столовыми ложками порошка. Накройте сухие кубики льда в ткань и распылить кубов с помощью молотка. Поместите серебряную фольгу (примерно 5 см х 5 см) на слой сухих кубиков льда и покрывают фольгой серебро с сухим льдом порошка. Поместите область спинного мозга, выбранные для дальнейших анализов на сухой лед порошка с помощью пинцета, пусть оснастке замораживать, и передать спинной мозг к крио трубки. Так держать на сухом льду в любое время или хранить его при температуре -80 ° C до тех пор, пока в дальнейшем наме. Перенести спинной мозг к криостат (-20 ° С). При необходимости, обрезать спинной мозг внутри криостата. Поместите спинной мозг в встраивание материала внутри криостата для того, чтобы прикрепить ее к образцу диска. Нарежьте спинного мозга в желаемой толщины, например , 5 мкм, и собрать на стеклянных пластинах. Нагреть стеклянные пластины с пальцем непосредственно перед началом сбора ткани для лучшего крепления. Хранить неизрасходованная ткани в крио пробирках при -80 ° С до дальнейшего использования. Оставьте секции на стеклянных пластинах внутри криостата до готовности для последующей фиксации. После фиксации секций путем погружения в 4% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре. Выполнение окрашивания в соответствии со стандартными протоколами 8. Фиксированный ткани для крио секционирования (применительно к спинному мозгу и КСГ) Фикс спинной мозг и ДРГ в 4% PFA (2 ч для спинного мозга, 1,5 ч для КСГ мыши и 4 ч для КСГ крыс) в4 ° С (место спинного мозга в горизонтальном положении, чтобы не допустить его фиксации в согнутом положении). Передача ткани до 25% вес / объем сахарозы в течение ночи при температуре 4 ° С. Ткань может храниться в 25% вес / объем сахарозы с добавлением нескольких капель 10% азида натрия, чтобы предотвратить микробное загрязнение при температуре 4 ° С до дальнейшего использования. При необходимости, обрезать спинной мозг, чтобы компенсировать расширение поясничного только на силиконовой борту или аналогичный. Используя кончик бумажного полотенца, аспирация избыток раствора сахарозы из ткани. Заполните крио формы наполовину с вложением материалов. Нажмите пузырьки по бокам крио пресс-формы с помощью инструментов, таких как закрытые пинцетом. Поместите ткань на вложении материала с помощью пинцета и обеспечить ориентацию желаемой ткани. Заполните форму крио полностью с вложением материалов и нажать пузырьки подальше от ткани , насколько это возможно (например , при использовании закрытых пинцет). Заполните чашку Петри (100 ммв диаметре) с 2-метилбутана. Это вещество является вредным. Выполните этот шаг в вытяжном шкафу и обработать веществом в соответствии с директивами учреждения (ВНИМАНИЕ: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). Поместите чашку Петри на слой сухого льда и добавить два сухих кубиков льда в чашке Петри. Поместите крио плесень в чашку Петри и позволяют вложение материал замораживать полностью. Хранить внедренный ткани на сухом льду в любое время или при -80 ° С не обернутой в Parafilm до дальнейшей обработки. Разрежьте ткань на криостате (-20 ° C) в желаемой толщины, например , 5 мкм. Выполнение окрашивания в соответствии со стандартными протоколами 8. Фиксированный ткани для парафиновой-вложении (применимо к спинному мозгу и КСГ) Закрепить спинной мозг и ДРГ в 4% PFA (2 ч для спинного мозга, 1,5 ч для КСГ мыши и 4 ч для КСГ крыс) при 4 ° С (место спинного мозгав горизонтальном положении, чтобы не допустить его фиксации в согнутом положении). Передача ткани до 25% вес / объем сахарозы в течение ночи при температуре 4 ° С. Ткань может храниться в 25% вес / объем сахарозы с добавлением нескольких капель 10% азида натрия, чтобы предотвратить микробное загрязнение при температуре 4 ° С до дальнейшего использования. Изолировать область ткани интерес, например , спинного мозга расширения поясничного отдела. Заполните вложение формы наполовину с парафином. Охладить вложение формы кратко, поместив его на охлаждающем области вложения машины слегка затвердеть парафина. Это позволяет добиться более точного позиционирования ткани. Поместите ткань в желаемой ориентации в вложению пресс-формы. Заполните вложение формы с парафином и охлаждения немедленно. Поместите парафинсодержащего вложение пресс-формы при температуре 4 ° С в течение ночи, чтобы позволить ей затвердеть полностью и удалить парафиновый блок, содержащий ткань из вложения пресс-формы. Срезанные участки Oна микротом в желаемой толщины, например , 5 мкм. Выполнение окрашивания в соответствии со стандартными протоколами 8.