사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em> 체외</em제브라 피쉬> 난자의 성숙

관련 국가 및 / 또는 지역 동물 복지 기관에 의해 정의 된 모든 제브라 피쉬는 좋은 동물 관행에 엄격한에 따라 처리하고, 모든 동물의 작업은 적절한위원회 (위스콘신 – 매디슨 보증 번호 A3368-01 대학)에 의해 승인되었다. 동물은 26.5 ° C로 표준 조건 하에서 유지 하였다. 여성의 1. 사전 선택 참고 : 난 모세포는 성인 여성의 일반적 단계에서 I V로, 발달 단계의 범위에 걸쳐 (그림 2). 새로 개발 된 난자는 코호트 3, 14으로 표시로서 성공적인 자연 교배를 통해 기존 난자의 여성 퍼지 것은 난자 준비의 동기화를 증가시킨다. 약 팔일 후 퍼지 내에서 대부분의 난자는 체외 성숙의 개시를위한 최적 초기 단계 IV,에 있습니다. 이러한 동기화는 난자 그쪽의 수율을 증가t 실험 조작을 촉진, 체외 성숙의 전체 과정을 통해 갈 수 있습니다. 한 쌍의 교배에 물고기 물 조성물 (여기서 생선 설정 방법에 대해서는 앞의 설명은도 13을 참조 바다 염 14g 및 역 침투 물을 1000 L 당의 NaHCO3 150g, pH가 6.5-8.5 (바람직한 범위는 6.8 -7.5) 및 180-360 μS 도전율). 브랜드 등의 알을 참조하십시오. 추가 조리법 (13). 여덟 10 일에는 체외 배양 조작하기 전에, 상대 탱크에 원하는 변형의 한 남성과 한 여성 물고기를 전송하는 물고기 그물을 사용합니다. 쌍 여러 세트. 짝짓기 탱크 하룻밤을 둡니다. 그들이 저녁 동안과 다음 날의 오후를 통해 짝짓기를 할 수 있습니다. 짝짓기하는 동안 알을 산출하고 별도의 탱크에 그들을 배치 암컷을 분리하는 물고기 그물을 사용합니다. 식품 혼합물로 하루에 두 번이 여성 피드 containi염수 새우, 생선 식품 조각의 대략 같은 양을 겨. 음식의 양은 공급 시간이 약 20 분, 그러나 더 제공하는데 충분해야한다. 성숙 중간 2. 준비 참고 : 여성으로부터 난자를 제거하는 1 시간 이내에 체외 성숙 실험의 날에 성숙 매체를 준비합니다 (3 절 참조). 무균 조건 하에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 L 글루타민, pH가 7.0 라이 보 비츠의 L-15 배지 20 ㎖를 추가한다. 10 N NaOH를 사용하여 pH 9.0로 준비한다. 2 개 개의 분리 된 50ml 원추형 튜브에 라이 보 비츠의 L-15 배지의 pH 9.0, 9 mL를 넣고. 라벨 1 관 "+ DHP"다른 "-DHP." + DHP 튜브, 17α-20β 히드 록시 -4- pregnen -3- 온의 10 μL (DHP), DH 2 O의 490 μL, 10 % 소 혈청 알부민의 500 μL (BSA)을 추가한다. -DHP 튜브에 10 ㎎ / ㎖의 겐타 마이신, 400의 100 μL를 추가81, DH 2 O의 L, 10 % BSA 500 μL. 3. 난 모세포의 해부와 체외 문화의 개시 참고 : 체외 배양 실험은 그들이 자연의 짝짓기를 통해 알을 해제 8~10일 후 미리 선택된 여성으로 실시한다. 같은 날 만든 성숙 매체를 사용합니다 (섹션 2 참조). 절개 가능성 자연 교배를 통해 발생하는 프로세스를 모방 (생선 설비에서 미리 설정된 인공 조명에 의해 실험실에서 측정) 물고기 일주 사이클 (13)의 끝 부분에서 시작되는 경우 난자 적당히 성숙. 이 물고기는 표준 라이트 사이클 시설에 보관하는 경우 프로토콜의 가장 단계가 저녁에 수행되어야 함을 의미한다 (예를 들어, 8 오전 10시 빛을 기간 시설에 오후 6시 단계 3.2부터) 다른 작업 시간주기는 적절하게 시간 시프트 라이트 사이클도 가능하다. 1 개 M 트리스, pH를 9.0로 pH 7.0로 완충 DH 2 O에서 0.2 % tricaine 스톡 용액을 준비하고 4 ℃에서 용액을 유지한다. 이것은 미리 준비하실 수 있습니다. 시설에서 매일 빛주기의 끝 이전에 실험 0-4 시간을 시작합니다. 250 ㎖의 비이커에, 생선의 물 80 mL의 0.2 % tricaine 스톡 용액의 pH 7.0의 20 mL를 첨가하고 혼합한다. tricaine 솔루션에 미리 선택된 여성을 전송하고 과다 노출에 의해 그들을 안락사. 길 이동의 정지 후 15 분간 tricaine 용액 암컷 남기기. 숟가락을 사용하여, tricaine 솔루션에서 안락사 물고기를 수집하고 물고기 물에 잠시 그들을 씻어. 여분의 물을 흡수하는 종이 타월에 물고기를 놓습니다. 가슴 지느러미의 수준에서 안락사 물고기 목을 벨 깨끗한 면도날을 사용합니다. 해부 가위를 사용하여, 항문 영역의 전방 단부로부터 연장되는 물고기의 복부 측에 세로 절개. <li> 입사광과 해부 현미경 페트리 접시에 물고기를 놓습니다. 해부 한 쌍의 집게를 이용하여 4 mL의 라이 보 비츠의 L-15 배지 + DHP로 함유하는 35 X 10mm 배양 접시 난소 부 옮긴다. 참고 : 개발 난자를 포함하는 난소는, 내부 체강 내에서 불투명하고 덩어리 진 구조로 표시됩니다. 해부 집게를 사용하여 부드럽게 여포 대중으로부터 난자를 떼어 놓다. 정렬 초기 IV 모세포 (도 2B, 거의 최대 크기로, GV 고장 전에 어두운 불투명하고 난 모세포 세포질 내에 비대칭 위치한 명백 특징 GV). 초기 단계 (도 2a) 및 (DHP 처리 전에 난소도 2c에 해당하지만, 본 유사) 반투명 성숙 단계 V에서 알 난자 버린다. 참고 : 난 모세포는 초기 단계 IV, 성숙 단계 V의 oocyt 결과 초기 단계에서 성숙을위한 선택시험 관내 배양 조건 (도 2C 및 D) 후에 ES 3. 단계 IV 난자 적극적으로 제품을 생산하기 때문에,이 단계에서의 조작을 통해 RNA 주입 또는 MO의 도입을 통한 유전자 기능의 감소를위한 외인성 생성물의 발현을 허용한다. 4 mL의 라이 보 비츠의 L-15 배지 + DHP로 포함하는 제 35 X 10mm의 플라스틱 배양 접시에 초기 단계 IV 난자를 전송하는 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다. DHP의 + 용액을 함유하는 접시 -DHP 매체 최소량의 전송. 4. 난자 Microinjections 참고 : 체외 성숙에 진행 고립 단계 IV 난자 기능 조작 또는 태그 단백질 발현을위한 시약을 소개하는 미세 주입 할 수있다. 등의 mRNA 나 MO (섹션 4 참조)과 같은 시약의 미세 주입은 일반적으로 난자 체외 matu받은 때 행해진 다+ DHP 매체 배급은 앞서 defolliculation한다. 원하는 경우, 난자 성숙하기 전에 조작을 수행하기 위해 더 많은 시간을 허용하기 위해, 주사는 적어도 2 시간 동안 숙성 이전에, -DHP 매체에 행할 수있다. 그들은 이후 + DHP 매체에 전송 될 수 있습니다. 표준 표현 키트를 사용하여 mRNA를 준비. 50-500 페이지 / μL의 최종 농도로 주입을위한 100 ~ 500 페이지 / μL 재고로 -80 ° C에서 그들을 유지 RNA 수준의 물 (200 페이지 / μL 권장). 제조업체의 지침에 따라 물에 4 NG / μL의 농도 수법의를 준비합니다. 2 NG의 최종 농도로 이들을 주입 / μL (또는 같은 경험적으로 결정됨). 참고 : 주사는 일반적으로 (섹션 5에서 참고를 참조하십시오) defolliculation하기 전에 + DHP 매체에서 실시된다. mRNA를 주입하는 경우, 분사 직전에, 0.1 M KCl을 최종 용액을 달성하기 위해 RNA 수준의 역 침투 물을 0.2 M의 KCl을 사용하여 mRNA를 희석. 주입 수법의 경우, 분사 직전에, 0.1 M KCl을 최종 용액을 달성하기 위해 역 침투 물 및 0.2 M KCl을 사용하여 원하는 농도로 희석 MO들. 수동으로 미세 겸자와 난자를 보유하고 인출 유리 모세관 피펫으로 만든 바늘을 사용하여 야생형 단계 IV 난자로 약 1 거리 nL 주입. 이전 피쉬 초기 배아 (15)에 주입 표준 프로토콜에 기재된 바와 같이, 가열 된 유리 모세관 튜브를 당기는 주입되는 용액을 로딩하고, 겸자와 바늘 끝이 파손되어 유리 바늘을 준비한다. 참고 : 바늘이 점진적으로 테이퍼보다는 갑작스러운 일이 있다면 그것은 도움이됩니다; 이 바늘 끝의 휴식의 장소의 측면에서 더 많은 유연성을 허용하고 또한 주입 된 배아의 손상을 방지하는 데 도움이됩니다. 동일한 니들 배아 주사제로서는 용액을 사용하여 상기 미리 결정함으로써, 주입 볼륨을 조절원하는 양을 생산하는 마이크로 인젝터 압력 설정. 이러한 설정에 의해 결정될 수있다 모의 주입 이전에 15 바와 같이, 현미경 스테이지 교정 슬라이드 (0.01 mm) 및 주입 용액의 볼 루스에 원하는 직경을 얻기 위해 마이크로 인젝터의 설정을 조정하는 미네랄 오일 방울로. 5. 난자 성숙과 Defolliculation 참고 : 난자 성숙 과정에서 난자가 성공적으로 배양 조건의 평가를 허용하는, 점진적으로 반투명하게 될 것이다. 26.5 ℃에서 + DHP 매체 난자, 난자가 그대로 유지되도록하기 위해 주기적으로 (30 분마다)에 의하면 점진적 반투명 됨으로써 적절한 성숙을 겪고있다 (도 2C 참조) (적절한 주입이 경우 등) 성숙 배양을 계속 . 파스퇴르 피펫 어떤 용균 난자를 제거하고 폐기실험실 폐기물 비커에 매체의 품질을 유지합니다. 난자 용해의 양에 따라, 맑은 용액을 유지하기 위해 신선한 + DHP 매체의 약 절반 볼륨으로 배양액을 교환하십시오. 난자의 대부분은 반투명이되어 더 이상 알 수있는 GV가 (DHP의 치료에 약 2 시간을, D에 비해 그림 2C 참조)까지 체외 성숙 할 수있게합니다. 투과광 광학 ​​장치 해부 현미경을 볼 수 있습니다. 각각의 성숙 난자로부터 최 모낭 막을 제거한다. 난자와 막 사이에 증가 된 공간 영역에서 난포 막에서 눈물을 만들기 위해 여분의 미세 집게를 사용합니다. 막의 일부를 박리하고, 박리 부분을 누르면서 막 밖으로 난자 롤. 참고 : 기본 융모막 멤브레인이 과정에서 계란과 긴밀한 관계를 유지 일반적 것이다; 계란 행위 후ivation는, 상기 배아의 보호 층을 형성하기 위해 확장된다. (전형적으로 20 미만 μL 약 5-10 성숙한 난자 전송) 매체의 최소한의 볼륨으로 이동 defolliculated 모세포 배양 (+ DHP) 중 몇 방울 배양 접시 및 수정을 진행. 체외 배양 난자 제 시비 참고 : 얼음에 정자 솔루션, 약 2 시간 동안의 효능을 유지 아래 준비했다. 앞서 16, 17 바와 같이, 행크스 용액 500 μL 다섯 개 수컷에서 사용 고환 defolliculation 위하여 난자 성숙 단계의 끝 전에 가까운 정자 용액을 준비한다. + DHP 문화 매체에 defolliculated 난자에 정자 솔루션의 10 ~ 50 μL를 추가합니다. 10 초를 기다립니다. 피펫을 사용하여 난자로 배아 (E3) 매체의 몇 방울을 추가합니다. 와줘 1 분을 기다린 후 홍수E3 매체 먹었다. 주 : 5 mM의 염화나트륨, 0.17 mM의 KCl을 0.33 mM의 CaCl2를 0.33 mM의 황산, 1-5 % 메틸렌 블루 (13)를 다음과 같이 E3 배지의 조성이다. 반복 수정 된 배아의 큰 숫자를 얻기 위해 5.3, 6.2, 6.3 단계를 반복합니다. 기름지게 배아 개발을 허용합니다. 이전에 수정 (17, 18)을 준비에 기재 한 바와 같이, 성공적인 수정을 보장하기 위해 절단 단계를 통해 진행을 관찰하는 투과광 광학 장치 해부 현미경을 사용합니다.