해양 박테리아와 생태 독성 학적 방법<em> 비브리오 앵 귈라 룸</em> 환경 오염 물질의 급성 독성 평가
Summary
이 연구는 해양 박테리아 인 Vibrio anguillarum을 사용하여 나노 물질과 같은 새로운 오염 물질을 포함하여 오염 물질의 생태 독성을 평가하는 새로운 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 6 시간 노출 후에 박테리아 배양 가능성을 50 % 감소시키는 농도 인 LC 50 또는 사망률을 결정합니다.
Abstract
박테리아는 생태계의 중요한 구성 요소이며, 미생물 군집 변화는 생 지질 화학 순환 및 푸드 웹에 중요한 영향을 줄 수 있습니다. 미생물에 근거한 독성 시험은 비교적 빠르고 재현성 있고 저렴하며 윤리적 문제와 관련이 없기 때문에 널리 사용됩니다. 여기에서는 해양 세균 Vibrio anguillarum 의 생물학적 반응을 평가하는 생태 독성 학적 방법에 대해 설명합니다 . 이 방법은 환경 시료뿐만 아니라 나노 입자와 같은 새로운 오염 물질을 포함한 화학 물질의 급성 독성을 평가합니다. 종말점은 독성 물질에 노출되어 박테리아 배양 가능성 ( 즉, 복제 및 형성 능력)이 감소한 것입니다. 이러한 감소는 일반적으로 사망률이라고 할 수 있습니다. 이 시험을 통해 LC 50을 결정할 수 있습니다. 농도는 50 %의 박테리아가 활발히 복제되고 콜로니를 형성하게하는 농도입니다.6 시간 노출. 배양 가능한 박테리아를 식민지 형성 단위 (CFU)로 계산하고 "사망률"을 평가하고 대조군과 비교합니다. 이 연구에서는 구리 황산염 (CuSO 4 )의 독성을 평가했다. 명확한 용량 – 반응 관계가 관찰되었으며, 3 회의 독립적 인 시험 후에 평균 LC 50 은 1.13 mg / L였다. 이 프로토콜은 미생물과 기존의 방법에 비해, 광범위한 염분 범위에 적용 할 수 있으며 색깔 / 혼탁 샘플에 대한 제한이 없습니다. 그것은 노출 매체로 생리 식염수를 사용하여 조사 된 오염물과 함께 성장 매체의 가능한 간섭을 피합니다. LC 50 계산은 해양 환경의 생태 독성 평가에 일반적으로 적용되는 다른 생물 검정과의 비교를 용이하게합니다.
Introduction
생태 독성 시험은 생태계에 미치는 물리적, 화학적, 생물학적 스트레스 요인의 영향을 통합하여 표준 생물학적 모델로 화학 물질 또는 환경 시료의 독성을 평가합니다. 생태계의 복잡성으로 인해 생태 독성 위험 평가는 다른 영양 수준의 유기체를 포함하는 일련의 생물 검정을 고려해야합니다. 실험실 동물에 대한 독성 시험은 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리고 윤리적으로 문제가 될 수 있습니다. 동물 실험을 제한하고 대안적인 접근 방법 ( 예 : 박테리아 및 비 척추 동물)을 개발하려는 노력은 현재 EU 동물 보호 지침 (European Animal Protection Directive)을 포함한 현재의 유럽 법률의 틀에서보고 된 바와 같이 중추적 인 문제입니다. EU 화장품 지침 및 REACH를 준수합니다.
갑각류, 물고기 및 조류는 해양 환경에서 독성 측정에 주로 사용됩니다 1 . 박테리아는 중요한 성분입니다.생태계의 변화, 미생물 군집의 변화는 생물 지 화학 사이클과 기타 중요한 생태계 서비스에 중대한 영향을 줄 수있다. 미생물에 근거한 독성 시험은 상대적으로 빠르고, 재현성 있고 저렴하며 윤리적 문제를 제기하지 않기 때문에 인기를 얻고 있습니다 2 . 이 연구의 목적은 환경 오염 물질에 노출되었을 때 해양 박테리아 Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae)의 반응을 평가하기위한 생태 독성 프로토콜을 기술하는 데있다.
V. anguillarum 은 그람 음성, 짧은 곡선 형 막대 박테리아 (0.5 x 1.5 μm)로 극모를 가지고 있습니다. 일반적으로 염수 또는 염수에서 발견되는이 약은 최적 염분도가 약 20이고 최적 온도가 25 ~ 30 ° C 인 황 내성이다. 그것의 편재와 그 중요한 생태 학적 역할로 인해 유기체 모델로 선택되었습니다전 세계적으로 4 . V. anguillarum의 일부 혈청 형 은 다양한 해양 또는 소금기있는 어종 5,6에서 vibriosis를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 이를 위해 실험의 일부 단계에는 표준 미생물 학적 관행이 필요하지만 특별한 안전 장비 나 예방 조치가 필요하지 않습니다. 제안 된 독성 시험 프로토콜은 박테리아 배양 ( 즉, 복제 능력과 콜로니 형성 능력)을 종점으로 사용하고 LC 50을 결정할 수 있습니다. LC 50 은 박테리아의 50 % 감소를 일으키는 농도입니다. 6 시간 노출. Vibrio 에서와 마찬가지로 다른 미생물과 마찬가지로 우리가 일반적으로 사망으로 표시 한이 감소는 부분적으로 생존 가능하지만 VBNC (non-culturable) 단계의 개체 때문일 수 있습니다 7 . 본 연구에서는 구리 황산염 (CuSO 4) 의 독성 영향을 측정하기 위해이 방법을 적용했다.), 참조 독성 물질.
이 방법은 나노 물질과 같은 오염 물질을 비롯한 오염 물질 / 화학 물질의 생태 독성 평가에 적합한 미생물 기반 시험을 제공하기 위해 개발되었습니다. 미생물에 사용되는 기존 방법과 비교하여이 프로토콜의 신규성은 주로 노출 매체 및 종점과 관련이있다. 실제로, 노출은 생물 반응에 영향을 미칠 수있는 조사 된 오염 물질로 성장 매체가 간섭하지 않도록 식염수에서 수행됩니다 8 . 종말점은 생존 / 사망률에 근거한 해양 / 소금기있는 환경에서 생태 독성 스크리닝에 사용되는 다른 급성 종말점과 쉽게 비교 될 수있는 세균 배양 가능성 감소입니다. 또한이 프로토콜은 이미 대장균 9 에서 사용 된 액체 대 플레이트 마이크로 카운트 기술을 사용하여 용적을 줄이고 실험적 eff를 감소시킵니다ort (자세한 내용은 프로토콜의 3.3 및 3.4 단계 참조).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 선충 독성 물질 인 CuSO 4 의 독성 영향을 평가하기 위해 성공적으로 적용된 해양 박테리아 인 V. anguillarum 에 대한 새로운 생물 분석을 기술하여 선량 – 반응 관계를 입증합니다. 해양 박테리아 인 V. anguillarum 은 모델 내성 유기체로 선택되었는데, 이는 해양 생태계의 내성, 유비쿼터스 및 대표성 때문입니다.
이 시험은 염분 값 (5 ~ 40)의 넓은 범위에서 수행 할 수 있으며 미생물이 전체 시험 기간 동안 쉽게 생존 할 수있는 한 생리 식염수 및 합성 또는 천연 해수를 노출 매체로 사용할 수 있습니다. 이것은 기수와 해양 환경을 포함한 다양한 종류의 시료 분석을 가능하게합니다.
노출 단계에서는 오염 물질과의 간섭을 피하고 생물학적 반응에 미치는 영향을 피하기 위해 성장 매체가 필요하지 않습니다. The 프로토콜은 신뢰성 있고, 빠르고, 비용 효율적이며 비교적 쉽습니다. 액체 – 플레이트 마이크로 카운트 9 의 절차는 작은 정확도와 견고 함을 의미하지만 작은 (샘플) 볼륨을 사용하는 이점을 제공합니다. 세 번의 독립적 인 임상 시험과 각 치료법의 결과는이 방법의 높은 반복성을 보여줍니다. 생물학적 모델로서의 세균의 사용과 기술의 적응성은이 과정의 생태 학적 및 환경 적 관련성을 선호한다. 다른 중요한 기술적 인 문제는 박테리아 접종 물의 제조 정확성과 절차의 일부 단계에서 요구되는 무균 성입니다.
제안 된 시험은 다른 해양 생태 독성 시험 (24 ~ 96 시간)보다 더 빠르고 (6 시간) 고등 생물의 사용으로 인한 윤리적 문제를 제기하지 않는다. 또한, 기준 독성 물질에 대한 데이터는 급성 t로 얻은 것과 비교되는 LC 50 값을 보여준다 다른 해양 생물 10 , 11 에 대해 좋은 감수성을 보여줍니다. 박테리아 생물 측정법 중 V. fischeri 발광 억제 시험은 가장 보편적이며 잘 표준화 된 시험이다. 이 바이오 분석법은 매우 빠른 속도 (15-30 분)로 고상 시료의 시험에 적합하지만, 발색 측정을 방해하는 색이 있거나 탁한 시료의 영향을받을 수 있습니다. 염분은 위에서 언급 한 시험의 사용에있어 제한 요소이며, 2 % NaCl이 요구된다. 반대로, V. anguillarum 과 함께 제안 된 시험은 염분 값의 넓은 범위에서 저렴한 결과를 제공하고, 탁한 시료 나 착색 시료에 대해서는 제한이 없으며, 루미넌스 분석기와 비교하여 덜 비싼 장비를 필요로합니다. 우리 연구의 결과와 V. fisheri 14 ,ss = "xref"> 15 , 16 은 비교 가능한 EC 50 값을 보여 주며,이 생물 검정의 효과를 뒷받침합니다.
이 생물 검정은 현재 미생물에 대해 가능한 시험에서 사용되는 인구 증가율 또는 효소 활성 저해 대신에 일반적으로 사망률이라고하는 세균 배양 가능성의 감소를 평가합니다. LC 50 계산은 일반적으로 종말점으로 생존 / 사망률을 갖는 해양 환경에 대한 생태 독성 평가에 일반적으로 적용되는 다른 생물 검정과의 비교를 허용합니다. 이 시험의 신뢰성과 재현성을 평가 / 확인하고 규제 프로토콜에서의 표준화 및 사용을 지원하기 위해서는 시험 간 훈련이 시급히 필요하다.
나노 물질의 사용 증가와 환경에서의 잠재적 배출은 위해성 평가의 필요성을 의미한다. 그러나, clas이러한 신흥 오염 물질에 대한 육체 (생태) 독성 학적 접근법은 적절한 결과를 제공하지 않는 것으로 보이며 일부 적응이 필요할 수 있습니다 18 . 이 새로운 생물학적 분석법의 특징은 나노 입자의 독성 평가에 대한 쉽고 유용한 적용을 가능하게합니다. 사실, 서로 다른 염도에서 분석을 수행 할 가능성은 독성에 중대한 영향을 줄 수있는 환경 변수 변수 인 다양한 이온 강도 하에서 나노 입자 거동을 설명 할 것입니다 19 . 또한 유기 물질은 독성 영향을 증가시킴으로써 흡수를 촉진 시키거나 응집을 일으켜 생체 이용률을 감소시켜 독성을 감소시킬 수 있기 때문에 나노 입자의 생태 독성 평가에서 성장 매체와 영양소의 사용을 권장하지 않는다.
결론적으로, Vibrio anguillarum에서의 생물 검정은 ap해양 및 염류 환경의 상태를 평가할뿐만 아니라 고전 및 신흥 오염 물질에 대한 위해성 평가 도구를 제공합니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 "NanoBioTech ambiente salute"프로젝트 (NanoBioTech ambiente salute. Progetto 2 : Ambiente, Nanoparticelle의 환경 생태학 실험실 환경 측정)에 의해 재정 지원되었다. ( "나노 바이오 테크놀로지 : 환경과 건강, 프로젝트 2 : 환경. 생태 독성을위한 도구와 방법 regione Lazio-Consorzio Hypatia에서 LM에 부여 된 나노 입자 모니터링 " ). AR은 이전에 인용 된 프로젝트의 틀 아래 Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia 대학의 박사후 연구비에 의해 지원되었습니다. ISPRA-Tor Vergata University (N. 2015/52857)와의 협약은 시설의 상호 이용과 연구자 교환을 허용했다.
저자는 미생물 세계에 대한 관심을 높이고이 문제에 대한 연구를 향상시키기 위해 강력하게 도움을 주신 모든 미생물 활동에 대한 수호 천사 Maria Cristina Thaller 교수에게 감사드립니다. 저자는 Andrea Tornambè와 Eri를 감사하게 생각합니다.카 Magaletti는 식물성 플랑크톤 생태학 및 생태 독성학의 ISPRA 연구소와 소중한 협력을했습니다.
Materials
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4 ·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
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