Analyse Synaptische Modulation von<em> Drosophila melanogaster</em> Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

Die Modulation der synaptischen Funktion trägt zu der bemerkenswerten Fähigkeit des Nervensystems genau zu reagieren oder auf sich ändernde Umweltstimuli anpassen. Die präsynaptischen Vesikelfreisetzung Wahrscheinlichkeit Einstellen ist eine Möglichkeit , ¹ synaptischen Stärke zu steuern. Synaptische Vesikel – Freisetzung erfolgt an der aktiven Zone (AZ), einem spezialisierten Bereich der präsynaptischen Membran ^2. Die AZ wird durch eine Kassette von spezifischen Proteinen charakterisiert ^{3, 4.} Die meisten Proteine zu AZ Montage beitragen , werden in Nematoden, Insekten und Säugetieren ⁵ hoch konserviert. Neuere Studien legen nahe , dass das Niveau von neuronaler Aktivität der molekularen Zusammensetzung des AZ reguliert, das wiederum trägt zur Regelung der Funktionsausgang sowohl in vitro als auch in vivo ^{6, 7,}> 8. Wir fanden vorher , dass Photorezeptor AZs molekulare Umbau in Drosophila unterzogen werden nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht ^9. In diesem Zustand wurde beobachtet, dass die Anzahl der Bruchpilot (BRP) -positiven AZs in dem Photorezeptor Axone reduziert wurde.

Die Brp / CAST / ELKS Familie Proteine sind Grundbausteine von AZs in Wirbeltieren und wirbellosen Synapsen ^10. Bei Drosophila brp Mutanten, evozierte Vesikelfreisetzung ¹¹ unterdrückt ^{wird, 12.} Die 17 C-terminalen Aminosäurereste von Brp sind für synaptic vesicle clustering an der Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) ^{13, 14.} Diese Studien zeigten, die zentrale Rolle dieses Moleküls in AZ Organisation und Funktion. Mit einem neu entwickelten genetischen Werkzeug, synaptic tagging mit Rekombinations (Stern), Brpkann in vivo in spezifische Zelltypen, bei endogenen Expressionsniveaus und bei einer einzelnen Synapse Auflösung ¹⁵ beobachtet werden. Dieses Werkzeug ermöglicht es, die endogene Dynamik der Synapsen quantitativ in dem Komplex des zentralen Nervensystems zu bewerten.

Es wurden mehrere Studien Quantifizierungen einschließlich Synapsen basierend auf Daten aus der konfokalen Mikroskopie erhalten. Synaptische Veränderungen wurden durch Messen der Länge, die Fläche, das Volumen, die Dichte und das Zählen der Anzahl basierend auf hoch entwickelten Software-Anwendungen bewertet. Zum Beispiel stellt die Freeware ImageJ eine Quantifizierungsmethode für die gesamte synaptischen Bereich und Synapsendichte Maßnahmen an der Drosophila NMJ ^16. Die Anzahl der Kolokalisation Websites von Pre – und postsynaptischen Markern wurden ¹⁷ mit dem Plugin "Puncta Analyzer" auf der ImageJ Software – Plattform quantifiziert. Alternativ kann ein Multi-Paradigm numerischen Rechenumgebung basiertes Programm, Synapse Detector (SYND) können automatisch mit einem fluoreszierenden Marker markiert Dendriten von Neuronen Spuren und quantifiziert dann die synaptischen Proteinmengen als Funktion des Abstands von dem Zellenkörper ^18. Die Software Synaptische Puncta Analysis (SynPAnal), hat sich für die schnelle Analyse von 2D-Bildern von Neuronen erworben von konfokalen oder Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Die primäre Funktion dieser Software ist die automatische und schnelle Quantifizierung von Dichte und Intensität der Protein puncta ^19. Vor kurzem wurde eine automatische lernbasierte Synapse Erkennungsalgorithmus wurde für die Quantifizierung der synaptischen Zahl in 3D ^20, erzeugt wurde ²¹ die Vorteile der 3D – Visualisierung-Assisted Analysis (Vaa3D) Software nehmen.

Kommerzielle Bildanalyse-Software sind auch leistungsfähige Werkzeuge für die synaptische Quantifizierungen. Zum Beispiel kann die fluoreszenzmarkiertem Neurotransmitter – Rezeptoren oder eine präsynaptische AZ Komponente in drei Dimensionen mit Einzelsiebzug Synapse Auflösung in C. elegans ²² oder der Drosophila olfaktorische System ^{23, 24,} so dass Hunderte von Synapsen zu schnell charakterisiert innerhalb einer einzigen Probe quantifiziert.

Hier präsentieren wir eine Methode, durch eine maßgeschneiderte Bildanalyse-Software-Plug-in in einem Multi-Paradigma numerische Rechenumgebung implementiert, die halbautomatisch mehrere Aspekte der AZs analysieren können, einschließlich deren Anzahl, Verteilung und dem Grad der Anreicherung von molekularen Komponenten zu der AZ. Somit ist diese komplexe Analyse erlaubt uns, die Dynamik der synaptischen Komponenten in Axonterminalen unter verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten. Wir untersuchten die Wirkung von Licht-Exposition auf den Ausgangs Synapsen der erwachsenen Fliege Photorezeptoren. Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1)Vorbereitung zur Belichtung, 2) Dissektion, Immunhistochemie und konfokale Bildgebung und 3) Bildanalyse.