AlexaFluor 이 연구의 모든 동물 실험은 KU 루벤 (벨기에) (/ 2013 프로젝트 P174)의 윤리 심사위원회에 의해 승인되었다. 마우스는 음식 펠릿에 광고 무제한 액세스, 표준 조건 하에서 보관 및 수돗물, 그리고 통제 된 조건 (23 ± 1.5 ° C, 상대 습도 40-60%, 12/12 빛 / 어둠 사이클)에서 유지되었다. 1. 마우스 시중에서 판매하는 마우스 변형 (- 12 주 오래 된, 즉 C57BL / 6, 여성 8)를 사용합니다. 일반적으로, 4-5 마우스는 상기 실험에서 세포의 적절한 양을 산출한다. 위한 17β-에스트라 100 μL (E2) 용액 (100 NG / 100 μL)로 피하 손상 쥐 주입 연속 3 D 동물의 발정주기의 위상을 표준화 내막의 증식을 유도하기 위해 단리 전에 세포. 프로토콜을 시작하기 전에 마우스의 사이클 위상 검사의 필요성은 피할 수있다 BE3 D '에스트라 디올 처리의 원인. 2. 준비 100 NG / 아라 키스 오일 100 μL E2의 솔루션을합니다. 다섯 마우스 (1.2에서 설명)의 주사를, 1.5ml의 양이 필요하다. 1 ㎎ / ㎖의 원액을 1 mL의 에탄올에 1 mg의 E2를 녹여. 이 원액 1을 희석 : 1,000 아라 키스 오일에. 500 ㎖의 1X 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신으로 보충 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBBS) 중 (상기 HBSS + 라 함) 만든다. 문화 MESC에 여과 마우스 자궁 내막 기질 세포의 500 mL로 (MESC) 매체 페놀 레드, L- 글루타민 및 4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄과 둘 베코의 변형 이글 중간 / 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 아세트산, N – (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -N '- (2- 에탄 설 폰산) (HEPES), 10 % FBS, 0.5 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 100 μg의 / ㎖의 젠타 마이신을 함유하는 (푸rther)는 MESC 매체 라 함. 탈락시 문화 MESC에 필터링 2 % MESC 매체의 500 mL로 : 페놀 레드, L- 글루타민 및 2 % FBS, 0.5 μg의 / ML의 암포 테리 신 B를 포함하는 HEPES, 100 μg의 / ML의 겐타 마이신과 DMEM / F12. 여과 마우스 내막 상피 세포, 500㎖를 준비 (MEEC) 배지 : 10 % FBS, 0.5 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 100 μg의 / ㎖의 겐타 마이신, 25 % MCDB-105 배지, 5 μg의 / ㎖ 인슐린을 포함하는 DMEM (상기 언급 ) MEEC 매체로서. MESC 문화에 대한 폴리 – L – 라이신 (PLL) 코팅 된 커버를 준비합니다. 증류수 250 mL에 PLL의 25 mg을 녹이고. 0.22 μm의 필터를 사용하여 상기 용액을 필터. 12 웰 플레이트에 멸균 된 커버를 추가합니다. 커버 슬립에 용해 PLL의 300 μL를 추가합니다. 인큐베이션 30 분 후, 용액을 제거한다. (- 2개월 최대 1) 판은 4 ° C 더 사용할 때까지 저장할 수 있습니다. 10 ㎎ / ㎖ 원액 O를 준비F 형 콜라게나 -20 ° C에서 300 μL의 IA 저장 분취. 사용하기 전에 필터링합니다. 24 시간 격리하기 전에 필수 3. 준비 MEEC 문화 콜라겐 코팅 된 커버를 준비합니다. 증류수 0.02 M 아세트산 용액 (커버 슬립 당 1 ml)로 준비한다. 를 50㎍ / ㎖의 최종 농도를 얻기 위해 0.02 M로 아세트산 12 ㎖의 콜라겐 150 μL를 추가한다. 12 웰 플레이트에 멸균 된 커버를 추가합니다. 콜라겐 액 1 mL로 (3.1.2 참조)에 추가합니다. 37 ℃에서 O / N (최소 12 시간)을 인큐베이션. 격리 중 : 흡입에 의해 커버 슬립 오프 콜라겐 솔루션을 제거하고 (층류 캐비닛) 무균 환경에서 그것을 자연 건조를 할 수 있습니다. 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 커버 슬립. 10 mL를 함유하는 15 mL의 표준 튜브에 0.25 g 크레아틴을 추가하여 2.5 % 판 크레아틴 용액을 준비HBSS +. 용해도를 증가시키기 위해 1 시간 동안 (200 rpm으로) 37 ° C에서 상기 용액을 흔들어. 4 ℃에서 보관하십시오. 4. 분리 및 마우스 자궁 내막 상피 세포의 문화 (MEEC) 및 마우스 자궁 내막 기질 세포 (MESC) (상기 MESC 소화 믹스라고 함) 0.25 % 트립신을 함유하는 최종 용액 결국 2.5 % 크레아틴 용액 (3.2 참조)를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 트립신을 25㎎ 추가한다. 자궁의 분리 질 도말 검사와 동물의 사이클 단계를 확인합니다. 동물을 억제하고 50 μL PBS 3 부드럽게 질을 세척 – 5 회. 유리 슬라이드에 대한 최종 플러시를 수집합니다. 10 배 또는 20 배 대물 렌즈를 사용하여 명 시야 현미경 물질을 조사한다. 만 발정 단계에있는 마우스를 사용합니다. 이 단계는 질 세척의 각질화 된 상피 세포의 존재 (도 1 특징 </strong>). 이러한 자궁 경부 전위 또는 CO 2 – 유도 마취 등의 적절한 방법을 사용하여 동물을 안락사. 무균 환경을 생성하기 위해 70 % 에탄올로 시체 스프레이. 무균 수술 도구를 사용하여 복부를 열고 모두 자궁 뿔을 시각화하기 위해 따로 장을 밀어 넣습니다. 나팔관에서 가장 말단에 자궁 뿔을 잡아. 나팔관에서 자궁 뿔을 해부하고 지방과 결합 조직을 제거합니다. 자궁 체 위의 말단부에 뿔을 잘라 HBSS + 3 mL를 가진 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 모든 자궁 뿔이 수집 될 때까지 다른 혼과 다른 동물이 단계를 반복합니다. 더 입체경에서 (HBSS +에서) 자궁 경적을 청소하고 모든 잔여 지방이나 결합 조직을 제거합니다. 자궁 내강을 노출하고 일을 대체 할 길이 방향으로 열려있는 자궁 뿔을 잘라신선한 HBSS의 +와 새로운 배양 접시에서 전자 혼. 크레아틴과 트립신을 포함하는 15 ML의 튜브 모든 자궁 뿔을 전송합니다. 궤도 셰이커 (50 회전)에 4 ° C에서 60 분 동안 수평으로 품어. 흔들림없이 23 ° C (RT)에서 45 분 동안 수평으로 품어. 흔들림없이 37 ° C (수조)에서 15 분 동안 수평으로 품어. 한편 0.05 % 트립신 – 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 2.7 mL에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 주식의 300 μL를 용해하여 MESC 소화 믹스를 확인합니다. 참고 : 지금부터, 더 분리 단계는 층류 캐비닛에서 무균 환경에서 수행된다. 마우스 자궁 내막 상피 세포 (MEEC) 문화 배양 2 시간 후에, 조심스럽게 상층 액을 얻어 붓는다. 트립신을 불 활성화시키기 위해 냉간 MEEC 배지를 함유하는 페트리 접시로 옮기고 자궁을 5 분 동안 배양활동. 차가운 HBSS +의 3 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 자궁 전송. 10 초 동안 소용돌이는 상피 시트를 분리합니다. 3 ㎖의 HBSS + 깨끗한 페트리 접시에있는 자궁을 씻어. 단계를 반복 4.3.2 – 4.3.4 상피 시트를 포함하는 세 현탁액의 총을 얻었다. MESC 소화 믹스에 자궁을 전송하고 (200 RPM)를 흔들어 섞으면 서 37 ° C에서 30 분 동안 배양 (MESC의 추가 분리를 위해 4.4 단계로 이동합니다). 조직 파편을 제거하기 위해 100 ㎛의 나일론 메쉬 가볍게 세 세포 현탁액으로 피펫 팅 상피 시트를 복구. 5 분 동안 500 XG에 수집 된 세포 현탁액을 원심 분리기. MEEC 매체의 12 ㎖의 펠렛을 재현 탁하고 잘 섞는다. 중력 침강을 이용하여 나머지 MESC을 분리하기 위해 5 분 동안 상기 용액을 침전. 5 mL를 피펫을 사용하여 조심스럽게 상단 2 mL로 제거합니다. 셀 suspensio을 원심 분리기n은 5 분 500 XG에. 부드럽게 피펫 팅 아래로 MEEC 매체를 Resuspend. 추가 실험 (그림 2a)에 대해 원하는 밀도의 콜라겐 코팅 된 커버에 세포를 플레이트. 12 시간 이상 동안 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 참고 : RNA 또는 단백질 분리가 필요한 경우 6 웰 플레이트에 파종을 권장하면서 면역 형광 칼슘 이미징과 같은 기능 실험을 위해, 그것의 커버 슬립에 직접 세포를 판 것이 좋습니다. 마우스 내막 기질 세포의 분리는 불충분 할 수있는 하나의 소화 후에 세포의 순도와 같은 두 라운드로 분할된다. 자궁은 최적의 세포 회복 및 순도 두 번 소화하고 있습니다. 두 라운드에서 기술적 개입은 동일합니다. 연구자가 원하는대로 모두 발사로부터 수집 된 세포를 상기 실험에 유지 될 수있다. 마우스 자궁 내막 str을OMAL 셀 (MESC) 문화 : 1 차 라운드 첫 번째 소화 라운드의 시작하기 전에, 2.7 mL의 0.05 % 트립신 – EDTA 용액에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 주식의 300 μL를 용해하여 초 소화 믹스를 준비합니다. 이 혼합 단계 4.4.8 필요하다. 감기 (4 ° C) HBSS + 및 MESC 매체의 3 mL를 3 × 15 mL의 튜브 (튜브 X1, X2와 X3)와 세 개의 작은 배양 접시를 준비합니다. 인큐베이션 30 분 후, 10 초 동안 가볍게 자궁 함유 트립신 용액을 흔들어. MESC 세포는 자궁 조직으로부터 분리되고 트립신 용액에 남아있을 것이다. 감기 (4 ° C) HBSS + 3 mL로 포함하는 첫 번째 페트리 접시에 자궁을 전송하고 잘 헹구어. 트립신 활성을 저해하기 위해 원래 (단계 4.4.3 튜브) 자궁 뿔을 포함하는 튜브에 MESC 배지 3 ㎖을 추가한다. HBSS + MESC 매체의 3 용액을 포함하는 튜브 X1에 감기 (4 °에 C)와 페트리 접시에서 자궁을 전송하고 10 초 동안 부드럽게 흔들어. </li> 반복 4.4.4 (감기 (4 °의 C와 페트리 접시로 전송) HBSS +) 두 번 4.4.6 (튜브 X2와 X3에 전송) 단계를 반복합니다. 참고 : 마지막으로,이 프로토콜은 4 세포 현탁액가 발생합니다 : 하나의 튜브 트립신 용액과 MESC를 포함 MESC 매체 3 튜브 (튜브 X1, X2와 X3)를 포함. 단계 4.4.1에서 설명 된 바와 같이, 새로운 MESC 소화에 자궁 전송 수직 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 40 μm의 나일론 메쉬를 통해 네 개의 세포 현탁액을 전달하여 기질 세포를 수집합니다. MESC 추가로 5 ㎖의 메쉬를 헹군다. 7 분 동안 500 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 원하는 밀도 추가 실험을위한 PLL – 코팅 된 커버에 MESC 및 접시에 펠렛을 재현 탁. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 6 시간 또는 O / N – (4)의 최소 인큐베이션. 마우스 자궁 내막 기질 세포 (MESC) 문화 : 2 차 라운드 <올> 감기 (4 ° C) HBSS + 및 MESC 매체의 3 mL를 3 × 15 mL의 튜브 (튜브 Y1, Y2 및 Y3)와 세 개의 작은 배양 접시를 준비합니다. 4.4.7 – 반복 4.4.3 단계를 반복합니다. 40 μm의 나일론 메쉬로 자궁과 함께 마지막 세포 현탁액을 전송합니다. 나일론 메쉬를 통해 튜브 Y1, Y2 및 Y3의 내용을 전달하여 간질 세포를 수집한다. MESC 추가로 5 ㎖의 메쉬를 헹군다. 7 분 동안 500 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 추가 실험 (그림 2b)을위한 PLL – 코팅 된 커버에 MESC 매체와 플레이트의 펠렛을 재현 탁. 5 % CO 2와 37 ° C에서 6 시간 – 4의 최소 품어. 참고 : RNA 또는 단백질 분리가 요구 될 때 추천 6 웰 플레이트에 파종하는 동안 면역 형광 칼슘 이미징과 같은 기능 실험을 위해, 그것은, 커버 슬립에 세포를 도금하는 것이 좋습니다. 5. 멘틴/ 순수 MEEC 및 MESC 문화의 유효성에 대한 사이토 케라틴을 두 번 염색 커버 슬립에 세포를 시드. PBS는 궤도 셰이커 (50 회전)에 칼슘과 마그네슘을 포함하는 3 × 5 분을 씻으십시오. 하지 쉐이커에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (주의!)으로 세포를 고정한다. 셰이커 (50 회전)에 칼슘과 마그네슘없이 PBS로 3 배 씻으십시오. 쉐이커 (50 RPM)에서 10 분 동안 0.2 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면. 쉐이커에 PBS로 3 배 씻으십시오. 쉐이커에 2 시간 동안 PBS에서 5 % 염소 혈청 (GS)와 블록 (50 회전) 쉐이커 (50 회전)에 4 ° C에서 (: 500 1) 및 단일 클론 마우스 항 – 인간 pancytokeratin (1000 1) 단일 클론 토끼 항 – 인간 멘틴와 세포를 품어. 항체는 0.5 % GS로 PBS에 희석된다. 쉐이커 (50 회전)에 PBS로 세척 배. 이차 항체와 세포를 품어 (1 : 1,000 0.5 % GS에) 알렉사 플 루어 488 – 복합 항 – 토끼 IgG의 알렉사 플 루어 488 – conju쉐이커에 문이 항 – 마우스 IgG를. 쉐이커에 PBS로 3 배 씻으십시오. 마운트 DAPI 건조 O / N을 포함하는 수성 장착 매체 슬라이드. 매니큐어와 슬라이드를 밀봉하고 더 사용하기 위해 4 ° C에 보관 (그림 2A, B). 공 배양 시스템에서 체외 탈락 6. 참고 : 네 다섯 동물이 24 웰 플레이트에서 공 배양 시스템을 구축해야합니다. 바람직하게는 층류 캐비닛 하에서 무균 환경에서 다음 프로토콜을 계속한다. 추가로 24 웰 플레이트에있는 상피 세포 분리 (4.3에서 설명)의 원심 분리 및 / 또는 배양 단계 동안 세포 배양 물 삽입물을 준비한다. 24 웰 플레이트에 웰의 원하는 금액에 MESC 매체의 400 μL – (200)를 추가합니다. 멸균 집게를 사용하여 프리 필드 24 우물에서 삽입을 놓습니다. MEEC 펠렛을 재현 탁인서트를 통해 MEEC 중간 분할에 (단계 4.3.14) (작업 볼륨 : 150 – 삽입 당 300 μL). 배양을 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포. 간질 세포 격리의 두 번째 라운드 (단계 4.5.6) 후 (세포 배양 삽입과 호환) 또 다른 24 웰 플레이트에서 기질 세포를 시드. 물론 당 400 μL 세포 현탁액의 작동 볼륨을 사용합니다. 5 % CO 2 배양기에서 37 ℃에서 6 시간 – 기질 세포가 최소 4 첨부 할 수 있습니다. 기질 세포에 의해 커버되는 제 24 웰 플레이트에 처음 24 웰 플레이트에서 상피 세포로 덮여 세포 배양 삽입을 전송합니다. 멸균 집게를 사용하거나 그들의 매달려 다리에서 삽입을 누릅니다. 배양 3 기간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포 – 90 % 컨 플루 – 상피 세포까지 5 D는 단층 및 간질 세포 (80)를 달성 형성한다. 또한, 사용하는 Transepithelial 전기 저항 (봉사자)그랜트 등에 의해 기술 된 바와 같이 볼트 / 상피 옴 미터를 이용하여 상피 단층을 모니터링한다. 7. 800-1,000 / 웰의 값은 상피 단층 합류를 고려하기에 충분했다. 유리 피펫 또는 미세 피펫 팁을 사용하여 3 일 – 필요한 경우, 매체마다 2를 교체합니다. 인서트에 배지를 교체하기 전에 (하단 시드) 기질 세포의 배지의 교환과 함께 시작한다. 이는 37 ℃에서 예열 된 세포 배양 배지를 사용하는 것을 권장한다. 실험을 시작하기 전에 체외 탈락에 유도하기 탈락 매체를 준비합니다. 기질 세포의 웰 당 400 μL의 작업 볼륨을 사용합니다. -20 ° C에서 다음 원액 저장 분취 액을 준비한다. 에탄올 250 μM의 메드 록시 프로게스테론 (17) – 아세테이트 (MPA)를 준비합니다. 100 mM의 원액 8 Bromoadenosine 3 ', 5'- 초순수에 캠프를 준비합니다. 1 μM의 MPA와 2 % FBS를 포함 MESC 매체에서 0.5 mM의 캠프를 포함 탈락 매체합니다. 조심스럽게 우물에서 매체를 제거하고 기질 세포 상에 탈락 매체를 추가합니다. 제어 조건이 필요한 경우에는 2 % FBS를 함유하는 MESC 매체를 사용한다. 세포 배양 삽입에서 매체를 제거하고 세포에 MEEC 매체의 300 μL를 추가합니다. 5 % CO 2에서 37 ℃의 인큐베이터에 5 (D)에 대해 세포를 인큐베이션. 다섯 번째 하루를 보낸 후, RT-qPCR에 의한 기질 세포의 탈락의 정도를 평가 (아래 참조). 레사 주린 기반의 생존 시약을 사용하여 상피 세포의 생존을 확인합니다. MEEC 배지에서 생존 시약시 10 분 솔루션을 준비합니다. 새로운 24 웰 플레이트에 세포 배양 삽입을 전송합니다. 세포에 MEEC 솔루션 – 생존 시약 300 μL – (150)를 추가합니다. 에서 5 % CO 2에서 37 ℃에서 인큐베이션적어도 4-5 시간 또는 하룻밤 (보라색 / 분홍색 파란색) 색상 변화를 관찰함으로써 세포 생존 능력을 평가합니다. 주 : 바람직한 연구자로 탈락 또한 마우스 프로락틴 특정 ELISA를 사용하여 평가 될 수있다. QRT-PCR에 의한 탈락의 7.Validation 참고 : QRT-PCR에 의한 탈락의 검증을 위해,이 RNA 분석을위한 세포의 충분한 양을 받기 위해 중복 모든 테스트 조건을 수행하는 것이 좋습니다. 드 Clercq 등의 알에서 전술 한 바와 같이 정량적 RT-PCR이 수행된다. 8. 간단히 : 상업적인 RNA 분리 키트를 이용하여 총 RNA를 분리. 각각 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 방법을 이용하여 RNA의 양과 질을 평가한다. 총 RNA 1 μg의부터 제조 업체의 프로토콜에 따라, cDNA를 합성. QRT-PCR 반응을 수행하기 위해 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트를 사용한다. 세중의 모든 샘플을 실행합니다. 반응을 수행하는 것이 바람직한 하우스 키핑 유전자 및 프로락틴 (prl8a2)에 상용의 TaqMan 마스터 믹스 특정의 TaqMan 프로브를 사용한다.