JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Загрузка кальциевой красителя в нервные окончания лягушек через нервный культи: регистрация переходного процесса кальция в нервно-мышечном соединении лягушки

Published: July 08, 2017
doi:
10.3791/55122
, , , ,
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Scientific Centre, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics,Russian Academy of Sciences, 2Open Laboratory of Neuropharmacology,Kazan Federal University, 3Department of Radiophotonics and Microwave Technologies,A.N. Tupolev Kazan National Research Technical University, 4Department of Medical and Biological Physics,Kazan State Medical University

Summary

Здесь мы описываем метод загрузки чувствительного к кальция красителя через пень нерва лягушки в нервные окончания. Мы также представляем протокол для регистрации и анализа быстрых переходных процессов кальция в периферических нервных окончаниях.

Abstract

Одним из наиболее эффективных методов измерения уровня пресинаптического кальция в пресинаптических нервных терминалах является оптическая запись. Он основан на использовании чувствительных к кальции флуоресцентных красителей, которые изменяют их интенсивность излучения или длину волны в зависимости от концентрации свободного кальция в клетке. Существует несколько методов, используемых для окрашивания клеток кальциевыми красителями. Наиболее распространенными являются процессы загрузки красителей через микропипетку или предварительная инкубация с формами ацетоксиметилового эфира красителей. Однако эти методы не совсем применимы к нервно-мышечным переходам (NMJ) из-за возникающих методологических проблем. В этой статье мы представляем метод загрузки чувствительного к кальция красителя через нервный культ лягушки нерва лягушки в нервные окончания. Поскольку ввод внешнего кальция в нервные окончания и последующее связывание с кальциевым красителем происходят в миллисекундном масштабе времени, необходимо использовать быструю систему визуализации для записи этих взаимодействийнс. Здесь мы описываем протокол регистрации переходного процесса кальция с быстрой камерой CCD.

Introduction

Ионы кальция (Ca 2+ ) участвуют во многих процессах нейронной сигнализации, включая инициирование, поддержание и пластичность релиза 1 , 2 , 3 , 4 , 5 медиатора. По прибытии потенциала действия внеклеточный Ca 2+ входит в нервный конец и инициирует высвобождение нейротрансмиттера. В некоторых синапсах ток кальция может быть измерен непосредственно электрофизиологическими методами 6 , 7 , 8 . В случае нервно-мышечного перехода (NMJ) нельзя использовать прямой патч-зажим и двухэлектродные зажимные методы за счет минимального размера нервных окончаний.

Записи внутренних токов Ca 2+ от нервных окончаний в NMJ могут выполняться косвенными электронамиИологические методы 9 , 10 . Однако эти методы требуют предварительной обработки синапса блокаторами ионов натрия и калия. Оптические методы не требуют фармакологического разделения ионных токов в нервном терминале и позволяют регистрировать приток Ca 2+ , вызванный потенциалами действия, и последующее повышение ионов Ca 2+ в аксоплазме 11 , 12 , 13 , 14 . Эти методы основаны на регистрации изменений флуоресценции конкретных Ca 2+ -чувствительных красителей при связывании свободных ионов Ca 2+ 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .

Индикаторы Ca 2+ могут быть загружены в cEll с помощью различных методов, в зависимости от цели эксперимента. Исследователи используют ванновое применение мембранно-проницаемых форм красителей 20 , 21 , погрузка через патч-пипетку 22 или микроинъекцию 23 , 24 , 25 . Однако все эти методы имеют некоторые ограничения в случае NMJ из-за его особенностей в синаптической архитектонике. Для NMJ наиболее удобным и успешным методом является загрузка красителя через нервный культ, метод форвардного заполнения 26 , 27 , 28 , 29 . Этот метод можно использовать для загрузки различных флуоресцентных красителей в периферические нервные окончания. Этот метод был успешно использован для нервных терминалов Drosophila 28 , моторного нерва ящерицы28 , и клеммы 17 , 26 , 27 , 30 моторного нерва лягушки. В зависимости от исследуемого объекта, методические данные могут варьироваться. Стеклянную микропипетку можно использовать для небольших нервов у личинок 28 . Несколько исследователей описали способ 27 , 28, в котором свежесрезанный конец нерва, иннервирующий мышцу, погружен в колодец, предварительно заполненный красителем. Затем препарат оставляют на несколько часов для впитывания красителя. Краска впитывается аксонами и транспортируется к нервным окончаниям. В этой статье мы описываем метод загрузки индикатора флуоресценции в моторные нервные терминалы лягушки через нервный культи. В нашем протоколе используется наконечник пластиковой пипетки для инкубации ткани с красителем. Мы также описываем, как получить и проанализировать флуоресцентный тракт Са 2+nsients.

Protocol

Эксперименты проводились на изолированных нервно-мышечных препаратах кожной грудной мышцы у лягушки рана-дзимибунды . Размер животных обоих полов составлял около 5-9 см. Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами использования лабораторных животных Казанского федерального университета и Казанского медицинского университета в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Экспериментальный протокол соответствовал требованиям Директивы Совета Европейского сообщества 86/609 / EEC и был одобрен Этическим комитетом Казанского медицинского университета. 1. Подготовка решений Подготовка раствора Рингера. Подготовьте раствор Рингера: 113,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 3,0 мМ NaHCO 3 и 1,8 мМ CaCl 2 . Отрегулируйте pH до 7,2-7,4. Подготовьте раствор Рингера с низким содержанием Ca 2+ </Sup> и высокое содержание Mg 2+ : 113,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 3,0 мМ NaHCO 3 , 6,0 мМ MgCl 2 , 0,9 мМ CaCl 2 . Отрегулируйте pH до 7,2-7,4. Приготовление раствора для загрузки красителя. Подготовьте раствор на водной основе, содержащий HEPES-Na, при 10 мМ (рН 7,2-7,4). Добавить 14 мкл раствора HEPES во флакон с красителем 30 . ПРИМЕЧАНИЕ. Индикаторная краска Ca 2+ поставляется в 500-миллилитровом флаконе с 500 мкг порошка. Вихрь и спин вниз, чтобы тщательно перемешать. Разбавьте раствор до достижения конечной концентрации индикатора Ca 2+ до 30 мМ. Избегайте воздействия света и храните его при температуре -20 ° C. 2. Порядок нанесения красителя Рассекайте кожную грудную мышцу кусочком грудного прорезивного нерва. ПРИМЕЧАНИЕ. Процедура вскрытия доступнаВ бесплатной загрузке статьи от Blioch et al. , 1968 31 . Для процедуры вскрытия используйте два тонких щипца и ножницы для роговицы (см. Таблицу материалов ). Перенесите расчлененную ткань в чашку Петри, покрытую силиконовым эластомером, предварительно заполненную раствором Рингера, и закрепите ткань тонкими штифтами из нержавеющей стали так, чтобы она слегка растянулась в тарелке. Повторно заполните чашку Петри свежей аликвотой раствора Рингера. Удалите соединительные ткани. Не повредите нерв. Подготовьте заполняющую пипетку: используя лезвие бритвы, вырежьте кусок конической части стандартного пластикового наконечника пипетки размером 10 мкл длиной ~ 2 мм. Подготовьте кусок моделирующей глины, чтобы установить заполняющую пипетку на чашку Петри. Подключите заднюю часть заполняющей пипетки к пластиковому шприцу через силиконовые трубки и пластиковые соединительные адаптеры, изготовленные из наконечников пипеток. До dВы загружаете процедуру, удалите раствор Рингера из чашки Петри с помощью пластиковой пипетки. Высушите мышечный нерв, используя тонкий шприц; Это предотвратит разбавление красителя Ca 2+ при последующей загрузке заполняющей пипетки. Удалите индикаторную емкость Ca 2+ из морозильника и дайте ему оттаивать при комнатной температуре в темном месте. Под контролем стереомикроскопа с малым увеличением (10 ×) обнаруживают соединение между мышцей и нервом. С тонким пинцетом и ножницами отрежьте грудной протрузивный нерв близко к поверхности мышц (см. Шаг 2.1). Оставьте нервный культи длиной около 2 мм. Закрепите наполнительную пипетку, прикрепленную к трубке, и шприц на чашке Петри, используя модельную глину. Переместите кончик пипетки близко к нервному культи. Не зажимая его, аккуратно аспирируйте нервный культ в кончик заполняющей пипетки. Снимите всасывающий шлангT конец заполняющей пипетки. Осторожно удалите избыточный раствор из наполнительной пипетки с помощью шприца с длинной иглой (см. Таблицу материалов ). Не зажимайте нервный культи. Вертикально поднимите наконечник пипетки, удерживая наконечник нерва в отсасывании. Изолируйте аспирационную часть нервного пена снаружи наконечника пипетки, используя вазелин. Высушите нервную культуру, изолированную в наполнительной пипетке, если необходимо: аккуратно аспирируйте избыток раствора из наполняющей пипетки с помощью шприца с длинной иглой. Нанесите 0,5 мкл раствора для загрузки красителя (см. Шаг 1), используя пипетку с длинным наконечником пипетки. Аккуратно вставьте наконечник пипетки с загрузочным раствором в наполнительную пипетку. Извлеките смесь непосредственно на культи нерва. Запечатайте открытый конец заполняющей пипетки вазелином. Добавьте небольшую аликвоту Ringer's sОливковое масло для чашки Петри, чтобы держать препарат мокрым. Инкубируйте препарат при комнатной температуре в темных и влажных условиях в течение 5 часов. Удалите заполняющую пипетку загрузочным раствором, промойте препарат раствором Рингера и храните его в течение ночи в холодильнике при 8 ° C. 3. Подготовка ткани для микроскопии Подготовьте препарат в камеру, покрытую силиконовым эластомером, и закрепите его стальными микроигонами так, чтобы он слегка растягивался. Промойте ткань аликвотой свежего раствора Рингера. Используйте всасывающий электрод для стимуляции нерва; Построение электрода можно получить из бесплатной загрузки статьи Kazakov et al. , 2015 год 32 . Расположите наконечник электрода близко к разрезающему концу нерва и влейте в него нервную культуру в отверстие электрода. Установите подготовительную камеру на ступень микроскопа. ПлацE температурный зонд и входные и выходные обмотки в камере. Подключите шнур питания к элементу Пельтье. Чтобы переработать препарат, используйте простую систему с гравитационным управлением. Чтобы удалить избыточный раствор, включите перфузионный всасывающий насос. Включите термоконтроллер. Установите регулятор температуры на 20 ° C. Установите защитный экран ультрафиолета. Подключите стимулирующий проволочный электрод к электрическому стимулятору и наблюдайте за мышечными сокращениями под микроскопом с 4-кратным объективом. Заполните перфузионную систему раствором Рингера с низким содержанием Ca 2+ и высоким содержанием Mg 2+ . ПРИМЕЧАНИЕ. Это решение используется для предотвращения мышечных сокращений. Снижение концентрации внешнего кальция и повышение внешнего магния приводит к уменьшению амплитуды переходных процессов Ca 2+. Однако , исходя из предыдущего опыта, 0,9 мМ CaCl <sub> 2 и 6 мМ MgCl 2 все еще достаточно, чтобы надежно разрешить амплитуду переходных процессов Ca 2+ . Стоит отметить, что существуют и другие способы уменьшения мышечных сокращений без снижения концентрации Ca 2+. Например, использование d-тубокурарина или альфа-бунгаротоксина, специфических блокаторов никотиновых рецепторов ацетилхолина, полностью или частично блокирует мышечные судороги 17 , 27 , 28 , 30. Однако добавление этих токсинов также может влиять на введение пресинаптического кальция 33 . Чтобы этого избежать, можно использовать μ-конотоксин GIIIA 27 . Включите насос и начните суперфузию препарата раствором Рингера с низким содержанием Ca 2+ и высоким Mg 2+ . Переключитесь на объектив 40 × на микроскоп. Включить t Он монохроматор (см. Таблицу материалов ). Выберите длину волны излучения 488 нм и непрерывный режим освещения в программном обеспечении управления монохроматором. При большом увеличении в режиме флуоресценции убедитесь, что нервные окончания загружены красителем. Рисунок 1 : Нерв и клеммы с нагруженным индикатором Ca 2+ . ( A ) Нерв, заполненный индикатором Ca 2+ после процедуры загрузки. Шкала шкалы = 200 мкм. ( B ) Нервные окончания, заполненные индикатором Ca 2+ . Шкала шкалы = 20 мкм. ( C ) Ca 2+ -индикаторная флуоресценция хорошо видна в нервном окончании. Шкала шкалы = 20 мкм._blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка. Позвольте препарату уравновешиваться в течение минимум 30 минут в растворе с низким содержанием Ca 2+ и высоким содержанием Mg 2+ . 4. Захват видео с помощью цифровой ПЗС-камеры Примечание. Детали захвата сигналов флуоресценции специфичны для каждого микроскопа и типа камеры, но ключевым соображением является скорость захвата изображения. Используйте 1 кГц в качестве минимальной частоты захвата для регистрации одиночных переходных процессов Ca 2+ в NMJ. ПРИМЕЧАНИЕ. Для флуоресцентной визуализации необходимы быстрые цифровые ПЗС-камеры (см. Таблицу материалов ). Система сбора данных и программное обеспечение (см. Таблицу материалов ) использовались здесь для синхронизации камеры, монохроматора и стимулятора. Короче говоря, этот протокол позволяет генерировать импульсы синхронизации на цифровых выходах данныхЧтобы открыть затвор, захватить видеосигнал и инициировать стимуляцию. Все временные параметры могут быть установлены в протоколах и / или на устройствах. Типичным протоколом является серия из 500 кадров, полученных с частотой 1 кГц (80 х 80 пикселей). Освещение светом возбуждения может отбеливать индикатор Ca 2+ и фотопамять клеточной ткани. Таким образом, избегайте длительного воздействия света возбуждения. В этом протоколе затвор открыт только на время, необходимое для захвата видео. Приобретите двадцать серий на конкретный нервный терминал. Цель здесь – следить за тем же сайтом в контрольной группе и после доставки лекарств. Под объективом 4X объектива микроскопа используйте режим яркого поля, чтобы визуализировать мышцы и нервные ветви. Переключитесь на объектив 40X и, используя режим эпифлуоресценции и длину волны возбуждения 488 нм, выполните поиск нагруженных красителем нервных окончаний. Определите интересующий вас нервный регион. На тринокулярной трубке oF микроскоп, выберите уровни обмена световым путём: 100% свет для камеры. Запустите программное обеспечение для сбора данных для ПЗС-камеры. В режиме «Live» найдите ROI и настройте фокус. Выберите меню «Изменить». Используйте «Базовая конфигурация» со скоростью 1000 кадров в секунду (fps) с разрешением 80 x 80. Установите количество входных кадров на 500. Введите название эксперимента. Выберите «Внешний триггер». Установите время до триггера до 10 мс. Установите количество повторов до 20. В программном обеспечении управления монохроматором выберите длину волны излучения 488 нм и режим «внешнего триггерного освещения». Запустите программное обеспечение для сбора данных. Загрузите протокол стимуляции. Прежде чем записывать видео, снимите темную рамку с помощью программного обеспечения для сбора видео. Запустите протокол стимуляции. Выберите ROI и checK записанный сигнал. 5. Анализ данных NoOTE: для анализа данных используйте программное обеспечение камеры CCD и ImageJ; Данные представлены в виде кривой в программе электронных таблиц. В программном обеспечении камеры CCD среднее значение 20 повторяется и экспортирует результаты в файл поддержки ImageJ. В ImageJ выберите ROI и фон. Вычтите фон из ROI. Представляют данные как отношение: (ΔF / F 0 -1) x 100%, где ΔF – интенсивность флуоресценции во время стимуляции, а F 0 – интенсивность флуоресценции в состоянии покоя. В программном обеспечении для получения CCD-камеры нажмите «Файл»> «Средние файлы». Выберите файлы и усредните их. Сохраните усредненный файл как .fit-файл, нажав «Сохранить как подходящий файл». Запустите программное обеспечение ImageJ. Выполните следующие действия: Нажмите «Изображение»> «Настройка»> «Яркость / контрастность». Нажмите «Изображение»> «Стеки»> «Инструменты»>; Стековый сортировщик. Нажмите «Анализ»> «Инструменты»> «Менеджер ROI». Перетащите усредненный файл .fit в окно ImageJ. Увеличьте масштаб окна, чтобы получить лучшее представление. Перемещая курсор, выберите последний кадр и удалите его (это темный кадр) Выберите прямоугольный ROI над областью, которая считается фоном. Добавьте его в менеджер ROI Измерьте фон, нажав «Дополнительно»> «Мультимедиа». Обратите внимание на MEAN. Скопируйте данные, экспортируйте их в программу электронных таблиц и вычислите среднее значение порога для коэффициента. Вычтите порог из стеков, нажав «Процесс»> «Главная»> «Вычесть». Введите усредненное значение порогового значения. Выберите прямоугольный ROI вокруг нервного терминала. Добавьте его в менеджер ROI. Измените значение, нажав «Дополнительно»> «Мера». Обратите внимание на MEAN. Скопируйте и экспортируйте его в программу для работы с электронными таблицами. Среднее смещение сигналов. ПРИМЕЧАНИЕ. ИспользуйтеПервые несколько десятков точек, демонстрирующих флуоресценцию базового красителя без стимуляции; Это флуоресценция в состоянии покоя. Разделите сигналы флуоресценцией в покое. Вычтите «1» и умножьте на 100%. Постройте сигнал и вычислите амплитуду переходного процесса Ca 2+ .

Representative Results

После загрузки красителя и стимуляции двигательного нерва в нервных окончаниях может быть обнаружено увеличение амплитуды флуоресцентного сигнала (переход Ca 2+ ) (см. Рис. 2 ). Параметры переходных процессов Ca 2+ представлены в таблице 1 . Количественно параметры переходных процессов Ca 2+, измеренные в нашем исследовании, близки к данным, полученным другими учеными в синапсах хладнокровных животных 15 , 34 . Параметры переходных процессов Ca 2+ зависят от скорости связывания Ca 2+ с красителем и последующей диссоциации. Скорость поступления Ca 2+ в нервное окончание, взаимодействие с красителем и диффузия в цитоплазме влияют на время нарастания переходного процесса Ca 2+ . Время затухания флуоресцентного сигнала зависит от сродства красителя,Скорость взаимодействия Ca 2+ с внутриклеточными буферами и удаление ионными насосами 35 . Амплитудный анализ переходных процессов Ca 2+ можно использовать для изучения влияния различных веществ на вход кальция, который участвует в высвобождении нейротрансмиттера 33 . Рисунок 2 : Среднее значение Ca 2+ Переходный, измеренный в лягуше NMJ. Переходный переход Ca 2+ рассчитывали на основе среднего значения сигналов от 13 NMGs лягушек. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Вершина горыΔF / F (%) Время нарастания 20% -80% (мс) Τ (ms) 12,6 ± 1,1 (n = 13) 4,6 ± 0,5 (n = 13) 115,3 ± 8,3 (n = 13) Таблица 1: Усредненные параметры переходного процесса Ca 2+ . Данные представлены как среднее ± SE; N – количество измерений в отдельных NMJ. Пик ΔF / F представляет собой усредненную амплитуду ΔF / F.

Discussion

В этой статье мы представили метод проведения насыщения Ca 2+ -чувствительным красителем в нервных окончаниях лягушки через нервный культи. К концу процедуры загрузки все терминалы в проксимальной части нерва имеют значительные уровни флуоресценции. Было подсчитано, что внутритерминальная концентрация зонда колеблется между 40 и 150 мкМ 17 .

Процедура инкубации проводится в два этапа: при комнатной температуре и затем при более низкой температуре в холодильнике. Важно контролировать время инкубации ткани с красителем при комнатной температуре. В зависимости от фактической длины культи нерва, специфического красителя и температуры время инкубации может изменяться. Если переэкспонировано, клеммы в проксимальных частях, близких к пням нерва, могут быть перегружены. Однако в средней части нерва все еще можно найти терминалы, которые удовлетворительно загружены. Во времяДлительная инкубация в холодильнике, краситель равномерно распределяется по нервным окончаниям.

Наши собственные наблюдения 33 , 35 , а также данные других исследователей 30 доказывают отсутствие какого-либо заметного влияния процедуры нагружения на амплитуду постсинаптического отклика или на частоту миниатюрных потенциалов концевых пластин. Хорошее долголетие было зафиксировано в загруженных препаратах. Есть несколько важных моментов, на которые мы хотели бы обратить внимание. Очень важно поместить нервный культ в раствор для загрузки красителя в течение нескольких минут после удаления, чтобы краска могла войти в аксоны срезанного нерва; Задержки могут привести к неэффективной нагрузке, по-видимому, из-за повторного запечатывания нервных аксонов 27 , 36 . Некоторые исследователи погружают нервную культуру в 100 мМ ЭДТА (Ca 2+ – и Mg 2+ -литератор) Сразу после удаления нерва, чтобы предотвратить резание разрезанных аксонов. Буфер удаляют через 1-2 мин и заменяют раствором для загрузки красителя 37 . Использование бутылки с нефтяным железом вместо пластиковых труб для процедуры загрузки позволяет использовать более короткий нервный культи. При использовании этого подхода нерв разрезается после того, как он погружен в раствор HEPES с красителем, и аксоны не запечатываются из-за отсутствия двухвалентных ионов в растворе красителя 27 , 28 .

В нашем исследовании мы использовали водорастворимую соль с индикатором Ca 2+ вместо декстрана. Конъюгаты декстрана диффундируют в аксоне медленнее, чем соли. Однако использование декстранового конъюгата уменьшает компартментализацию красителей и обработку нервами и NMJ. Кальций зеленый Конъюгат декстрана с энергией 1-3 000 МВт имеет хорошую скорость диффузии и демонстрирует снижение компартментализации <s Up class = "xref"> 38.

Очень важно избегать длительного периода флуоресцентного освещения ткани, поскольку это влияет на его здоровье и выживание. Мы используем оптику Nomarski в канале видимого света для поиска нервных терминалов. Во время записи мы ограничиваем освещенное поле с помощью диафрагмы.

Следует отметить, что этот метод загрузки подходит только для препаратов, которые могут выдерживать длительные инкубации. Чтобы уменьшить время загрузки красителя, когда исследования проводятся на более хрупких тканях ( например, синапсы теплокровных животных), необходимо уменьшить масштаб нервной культи и использовать микропипетки для загрузки 29 , 39 .

Эта методика загрузки хорошо подходит для визуализации изменений в цитозольном Ca 2+ , с флуоресцентными показателями как при стимуляции одной нервной системой, так и в ритмической синаптической активностиEf "> 17 , 27 , 35. Анализ амплитуды перехода Ca 2+ может быть использован для изучения влияния различных веществ на вход кальция, который участвует в высвобождении нейротрансмиттера 33 .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование проводилось в рамках Программы конкурентоспособности России при Казанском федеральном университете и гранта Российского фонда фундаментальных исследований (16-04-01051, 16-34-00817, 15-04-02983). Мы благодарим четырех анонимных рецензентов за предоставление полезных комментариев по более ранним черновикам рукописи. Выражаем благодарность Юлии Арацской за запись голоса. Мы благодарны д-ру Виктору Ильину за многочисленные полезные комментарии и помощь в финальном редактировании рукописи.

Materials

Ca2+ indicator Molecular Probes, USA Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 500 μg
Silicone Elastomer Dow Corning, USA Sylgard 184 elastomer
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10µL
Pipette tip Fisher Scientific, USA 02-707-175 10µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10µL
Razor Blade Fisher Scientific, USA 12-640
Minutien Pins Fine scince tools, Canada 26002-20
Corneal Mini-Scissors MT MEDI CORP, Canada S-1111
Jeweler Forceps MT MEDI CORP, Canada F-9610
Jeweler Forceps MT MEDI CORP, Canada F-9611
Modelling clay local producer can be replaced by any local producer
Petroleum jelly local producer can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400  Biosan, Latva BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latva BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40mm
Syrynge local producer 0.5 ml
HEPES  Sigma-Aldrich, USA H0887 100ml
Microscope, BX51 Olympus, Japan
Stereomicroscope, Leica М80 Leica Microsystems , Germany 
Illumination system Leica CLS 150Х  Leica Microsystems, Germany 
Data acquisition system  Molecular Devices, USA Digitdata 1550
software Molecular Devices, USA pClamp software, Version 10 protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with.
RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler Experimental Builder can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ 
Monochromator Till Photonics, Germany Polychrome V no longer available, can be replaced by other   sutable stable light source 488 nm
monochromator control software Till Photonics, Germany Polycon
Digital CCD camera Redshirt imaging, USA Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator A-M Systems, USA
Suction electrode Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. -  2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-
biologicheskix-obektov/
Acquisition software for CCD camera Redshirt imaging, USA Turbo SM software
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. Science. 256, 677-679 (1992).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release?. Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).
  6. Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse. Nature. 383, 431-434 (1996).
  7. Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem. J Physiol. 506, 143-157 (1998).
  8. Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).
  9. Molgó, J., Mallart, A. Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse. Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).
  10. Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction. J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).
  11. Haugland, R. P., Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  13. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
  14. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).
  15. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. J Physiol. 505, 585-592 (1997).
  16. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).
  17. Suzuki, S. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).
  18. Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
  19. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).
  20. Regehr, W. G., Yuste, R., Konnerth, A. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual. , 307-314 (2005).
  21. Macleod, G. T. Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).
  22. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with Patch Pipettes. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).
  23. Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  24. Macleod, G. T. Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).
  25. Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation. Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).
  26. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10, 465-473 (1993).
  27. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  28. Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  29. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).
  30. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  31. Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse. J Physiol. (1), 11-35 (1968).
  32. Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel’skij zhurnal. 40 (9), 13-16 (2015).
  33. Khaziev, E. Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).
  34. Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs. J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).
  35. Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).
  36. Angleson, J. K., Betz, W. J. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).
  37. Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction. J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).
  38. Troncone, L. R., et al. Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom. J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).
  39. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).

Tags

Calcium DyeFrog Nerve EndingsNeuromuscular JunctionOptical RecordingCalcium TransientCalcium SignalingHEPESOregon Green BAPTARinger’s SolutionNerve StumpNerve EndingsMuscle Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (125), e55122, doi:10.3791/55122 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image