Yatay Gen Transferi Çalışmasında Metodolojisi<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
Burada Staphylococcus aureus konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümün, in vitro incelenmesi için, üç farklı protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Ana fırsatçı insan patojeni Staphylococcus aureus önemli bir özelliği, hızlı bir şekilde antibiyotiklere direnç elde etmek için olağanüstü yeteneğidir. Genomik çalışmalar S. aureus yatay gen transferi (HGT) S. aureus evriminde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir mobil genetik elementlerin bulunan birçok virülans ve direnç genleri taşıdığını ortaya koymaktadır. Ancak, yine de, eksik özellikle son zamanlarda bu bakterinin rapor edilmiştir doğal dönüşümü ile ilgili olan S. aureus HGT incelemek için kullanılan metodolojinin tam ve ayrıntılı bir açıklama. Konjugasyon faj iletimi ve doğal dönüşümün Bu çalışma, in vitro, S. aureus HGT incelemek için yararlı olan, üç protokollerini tasvir eder. Phenicols veren bu amaçla, cfr gen (kloramfenikol / florfenikol direnci), linkozamitler, Oksazolidinonlar, Pleuromutilins ve streptogramin A (PhLOPS içinA) fenotipi -karşı kullanılmıştır. S. aureus, diğer suşlar genetik materyaller aktaran geçtiği mekanizmaları anlamak direncin hızlı satın kavrama esastır ve yaygınlaştırma modları gözetim programlarında bildirilen veya gelecekte daha da yayılmasını moduna tahmin etmek netleştirmek için yardımcı olur.
Introduction
Staphylococcus aureus, doğal insan ve hayvanların deri ve burun boşluğu yaşar bir ortakçı Gram pozitif bir bakteridir. Bu bakteri türleri hastane ve sağlık ortamlarında hastane enfeksiyonlarının önde gelen nedenidir. Ayrıca, farklı antimikrobiyal bileşiklere direnç geliştirme kabiliyeti küresel bir endişe içine bu bakterinin neden olduğu enfeksiyonların yönetimini yapmıştır.
direnç fenotipleri yayılmasında karışan iki ana yollar bilinmektedir: dayanıklı genotiplerin klonal yayılmasını ve bakteriyel havuz arasındaki genetik belirleyicileri yayılmasını. S. aureus, farklı antibiyotik direnç genleri (ve hastalık oluşumunu belirleyen etkenin) durumunda, hareketli genetik elemanlara (MGES) ile ilişkili bulunmuştur 1. S. aureus genomunda bu unsurların varlığı gen kazanılması ve transfer olduğunu gösterirBakteriyel nüfus içinde etik malzeme S. aureus adaptasyonu ve evrim için önemli bir rol oynayabilir.
dönüşüm, konjugasyon ve faj iletimi: Genetik materyal, Gram-pozitif bakterilerde HGT üç iyi bilinen mekanizmalarla değiştirilebilir. Dönüşüm serbest DNA alımını kapsar. yetkinlik sahne: yabancı DNA elde etmek için, bakteri hücrelerinin özel bir fizyolojik faz geliştirmek gerekir. Bu aşamada ulaşıldığında, kompetan hücreler, sitoplazmaya DNA taşıyan yeni genetik determinantlar elde edebilmektedir. S. aureus durumunda, doğal transformasyon varlığı en son 2 gösterilmiştir. Buna paralel olarak, bizim grubun kurucu ifade reachin yeteneğine sahip S. aureus işler nasıl gelişme yeterlilik aşamasında ve üzerinde iç çekişi faktörünün ifade alaka (şifreli ikincil transkripsiyon sigma faktörü) ışık tutmuşturDoğal dönüşümü 2 ile dayanıklı fenotipleri edinimi için izin verir g yetkinlik sahne.
Konjugasyon başka bir (alıcı), bir canlı hücrenin (donör) DNA iletimi ile ilgili bir süreçtir. Her iki hücreleri, tüpler ya da gözenek gibi özel yapılar tarafından korunması suretiyle, DNA değiştirilmesine olanak verir, doğrudan temas içinde olması gerekmektedir. Bu yöntemle DNA transferi konjugatif makine gerektirir. S. aureus, prototip konjugatif plazmid konjugatif operon traa 3 barındıran PGO1 vardır.
Faj transdüksiyon bakteriyofaj enfeksiyonu yoluyla hücreden hücreye DNA transferini içermektedir ve faj kapsid içine yerine viral DNA'nın bakteriyel DNA ambalaj ifade eder. S. aureus izolatlarının çoğu bakteriyofajlar 1 ile lysogenized edilir. stres koşullarında üzerine prophages bakteriyel genom eksize edilebilirE ve litik döngüsü vardiya.
Bunlar S. aureus DNA aktarımı için üç iyi bilinen mekanizmalardır. Bu tür "sözde dönüşüm" 2 ve patojenite adaları 4 transferinde faj benzeri sistemler gibi bazı ek aktarım mekanizmaları vardır. Son zamanlarda, bir grup "nanotüpler" komşu hücreler 5, 6 arası (plazmid DNA dahil), hücresel materyallerin transferi dahil, ancak bir izlem çalışması şimdiye kadar diğer gruplardan ortaya olmadığını bildirdi.
Konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümü: Bu çalışma üç ana aktarma yollarının ele alarak S. aureus HGT incelemek için gerekli bir metodoloji sağlar. Bu yöntemler ile elde edilen sonuçlar arasındaki CFR gen iletimini (kloramfenikol / florfenikol direnci) yapısını incelemek için kullanılmıştırS. aureus 7 suşları. Bu üç teknik S. aureus MGE iletim soruşturma çok yönlü araçlardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu eser S. aureus genetik belirleyicilerin HGT incelemek için üç büyük yöntem açıklanır. Iletimi ve konjügasyon yıllardır incelenmiştir, ancak doğal dönüşümün mevcudiyeti son 2 tanındı. Böylece, S. aureus HGT üç ana modları hepsi ile donatılmıştır ve hepsi test genetik belirleyicilerinin olası yayma yolları açıklığa kavuşturmak için gereklidir. Bu çalışmanın amacı, tam protokolleri derlemek ve önceden yayınlanmış çalışmalar?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
References
- Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
- Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
- Caryl, J. A., O’Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
- Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
- Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
- Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
- Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
- Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
- Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically – Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).
- Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
- Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
- Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
- Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
- Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
- Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
- McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
- Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
- Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
