Metodologia para o Estudo da transferência horizontal de genes em<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
Descrevemos aqui três protocolos diferentes para a investigação in vitro de conjugação, transdução, transformação e natural em Staphylococcus aureus.
Abstract
Uma característica importante do grande agente patogénico humano oportunista Staphylococcus aureus é a sua capacidade extraordinária para adquirir rapidamente resistência a antibióticos. Estudos genómicos revelam que o S. aureus transporta muitos genes de virulência e resistência localizadas em elementos genéticos celulares, sugerindo que a transferência genética horizontal (HGT) desempenha um papel crítico na evolução S. aureus. No entanto, uma descrição completa e detalhada da metodologia utilizada para estudar HGT em S. aureus ainda está em falta, especialmente em relação transformação natural, que foi recentemente relatada nesta bactéria. Este trabalho descreve três protocolos que são úteis para a investigação in vitro de HGT em S. aureus conjugação, a transdução do fago, e transformação natural. Para este objectivo, o gene cfr (cloranfenicol / resistência florfenicol), que confere as fenicóis, Lincosamidas, Oxazolidinonas, pleuromutilinas, e estreptogramina A (PhLOPSA) -resistência fenótipo, foi usado. Compreender os mecanismos através dos quais S. aureus transfere material genético para outras estirpes é essencial para compreender a rápida aquisição de resistência e ajuda a esclarecer os modos de difusão relatados em programas de vigilância ou de prever ainda mais o modo de propagação no futuro.
Introduction
Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva comensais que habita naturalmente na pele e cavidade nasal do ser humano e animais. Esta espécie bacteriana é a principal causa de infecções nosocomiais em hospitais e estabelecimentos de cuidados. Além disso, a sua capacidade de desenvolver resistência a diferentes compostos antimicrobianos fez a gestão das infecções causadas por esta bactéria em uma preocupação mundial.
Duas principais vias envolvidas na divulgação de fenótipos de resistência são conhecidos: a disseminação clonal de genótipos resistentes e de difusão dos determinantes genéticos entre a piscina bacteriana. No caso de S. aureus, diferentes genes de resistência a antibióticos (bem como determinantes de virulência) foram encontrados para ser associado com elementos genéticos móveis (EGM) 1. A presença destes elementos no genoma de S. aureus indica que a aquisição e a transferência de genmaterial de etic dentro da população bacteriana poderia desempenhar um papel importante para a adaptação de S. aureus e evolução.
O material genético pode ser trocada através de três mecanismos bem conhecidos de HGT em bactérias Gram-positivas: transformação, conjugação e transdução do fago. Transformação envolve a absorção de DNA livre. Para adquirir DNA estranho, as células bacterianas precisam desenvolver uma fase fisiológicas especiais: a fase de competência. Quando este estado for atingido, as células competentes são capazes de transportar o DNA para o citoplasma, a aquisição de novos determinantes genéticos. No caso de S. aureus, a existência de transformação natural foi recentemente demonstrado 2. Em consonância com isso, o nosso grupo tem lançar luz sobre a relevância da expressão do fator de suspiro (um fator sigma de transcrição secundária enigmática) na fase de competência do desenvolvimento e sobre a forma como a sua expressão constitutiva torna S. aureus capaz de reaching o estágio de competência, o que permite a aquisição de fenótipos resistentes pela transformação natural 2.
A conjugação é um processo que envolve a transmissão de ADN a partir de uma célula viva (dador) para um outro (receptor). Ambas as células devem estar em contacto directo, permitindo que o ADN a ser trocados enquanto está a ser protegida por estruturas especiais, tais como tubos ou poros. A transferência de ADN por este método requer a maquinaria conjugativo. Em S. aureus, o plasmídeo protótipo conjugada é PGO1, que abriga o operon TRAA conjugada 3.
O fago de transdução envolve a transferência de DNA a partir de uma célula para outra por meio da infecção de bacteriófago e implica a embalagem de ADN bacteriana, em vez do ADN virai, na cápside do fago. A maioria dos isolados de S. aureus são lysogenized por bacteriófagos 1. Após a condições de stress, profagos pode ser excisado do genom bacterianae e mudança para o ciclo lítico.
Estes são os três mecanismos bem conhecidos para a transmissão do ADN em S. aureus. Existem alguns mecanismos de transferência adicionais, tais como "pseudo-transformação" e dois sistemas de fagos como na transferência de ilhas de patogenicidade 4. Recentemente, um grupo relatou que "nanotubos" estão envolvidos na transferência de materiais celulares (incluindo ADN de plasmídeo) entre células vizinhas 5, 6, mas um estudo de seguimento não apareceu a partir de outros grupos de medida.
Este trabalho apresenta a metodologia necessária para estudar HGT em S. aureus, abordando as três principais vias de transferência de conjugação, a transdução e transformação natural. Os resultados obtidos com estas metodologias foram usadas para estudar a transmissão do gene CFR (cloranfenicol / resistência florfenicol) entreS. aureus 7. Estas três técnicas são ferramentas versáteis para a investigação de transmissão MGE em S. aureus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve os três métodos principais para estudar a HGT de determinantes genéticos em S. aureus. Apesar de transdução e conjugação têm sido estudados há décadas, a existência de transformação natural só recentemente foi reconhecida 2. Assim, S. aureus é equipado com todos os três principais modos de HGT, e testar todos eles é necessária para esclarecer as possíveis vias de disseminação de determinantes genéticos. O objetivo deste trabalho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
References
- Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
- Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
- Caryl, J. A., O’Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
- Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
- Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
- Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
- Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
- Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
- Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically – Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).
- Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
- Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
- Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
- Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
- Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
- Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
- McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
- Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
- Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
