Methodologie voor de studie van horizontale genoverdracht in<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
We beschrijven hier drie verschillende protocollen voor de in vitro onderzoek conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie in Staphylococcus aureus.
Abstract
Een belangrijk kenmerk van de belangrijkste opportunistische humaan pathogeen Staphylococcus aureus is het buitengewone vermogen om snel resistent worden tegen antibiotica. Genomische studies blijkt dat S. aureus draagt vele virulentie en resistentiegenen in mobiele genetische elementen, wat suggereert dat horizontale genoverdracht (HGT) speelt een cruciale rol in S. aureus evolutie. Echter, een volledige en gedetailleerde beschrijving van de gebruikte HGT studeren in S. aureus ontbreekt nog, in het bijzonder met betrekking tot natuurlijke transformatie, die onlangs is gemeld in deze bacterie methodologie. Het beschrijft drie protocollen die bruikbaar zijn voor de in vitro onderzoek HGT in S. aureus conjugatie, faag transductie en natuurlijke transformatie. Om dit doel, de cfr-gen (chlooramfenicol / florfenicol weerstand), die de Phenicols verleent, Lincosamiden, oxazolidinonen, pleuromutilinen en Streptogramine A (PhLOPSA) resistentie fenotype, werd gebruikt. Het begrijpen van de mechanismen waarmee S. aureus overdraagt genetisch materiaal naar andere stammen is essentieel voor het begrijpen van de snelle verwerving van weerstand en helpt bij het vormen van verspreiding gerapporteerd bewakingsprogramma's of om verspreiding modus in de toekomst voorspellen verder verduidelijken.
Introduction
Staphylococcus aureus is een commensale Gram-positieve bacterie die van nature leeft in de huid en neusholte van mensen en dieren. Deze soorten bacteriën is de belangrijkste oorzaak van nosocomiale infecties in ziekenhuizen en instellingen voor gezondheidszorg. Bovendien is zijn vermogen om resistentie tegen andere antimicrobiële verbindingen aangaan het beheer van de infecties veroorzaakt door deze bacterie in een mondiaal probleem gemaakt.
Twee belangrijke routes betrokken bij de verspreiding van resistentie fenotypen bekend: de klonale verspreiding van resistente genotypes en de verspreiding van genetische determinanten van de bacteriële pool. Bij S. aureus, verschillende antibiotische resistentiegenen (en virulentie determinanten) werden in verband gebracht met mobiele genetische elementen (MGEs) 1. De aanwezigheid van deze elementen in het genoom van S. aureus aan dat de verwerving en overdracht van geneTIC materiaal in de bacteriële populatie kan een belangrijke rol weggelegd voor S. aureus aanpassing en evolutie spelen.
Genetisch materiaal kan worden uitgewisseld via drie bekende mechanismen van HGT in Gram-positieve bacteriën: transformatie, conjugatie en faag transductie. Transformatie omvat de opname van vrije DNA. Om vreemd DNA te verwerven, moeten bacteriële cellen om een bijzondere fysiologische fase te ontwikkelen: de competentie podium. Wanneer dit stadium is bereikt, competente cellen kunnen transporteren DNA in het cytoplasma, het verwerven van nieuwe genetische determinanten. Bij S. aureus, heeft het bestaan van natuurlijke transformatie onlangs aangetoond 2. In lijn met deze, heeft onze fractie licht werpen op de relevantie van de expressie van de zucht factor (een cryptische secundaire transcriptiefactor sigma factor) in de bevoegdheid stadium van ontwikkeling en over de wijze waarop de constitutieve expressie maakt S. aureus in staat reaching bevoegd fase, waardoor het verkrijgen van resistente fenotypen door natuurlijke transformatie 2.
Conjugatie is een proces dat de overdracht van DNA van een levende cel (donor) naar een andere (ontvanger). Beide cellen moeten in direct contact, waardoor het DNA te wisselen terwijl beschermd door speciale structuren, zoals buizen of poriën. De overdracht van DNA door deze werkwijze vereist de conjugatie machine. S. aureus, de prototype conjugatie plasmide PGO1, waarbij de conjugatie operon TRAA 3 herbergt.
Faag transductie omvat de overdracht van DNA tussen cellen met bacteriofaag infectie en impliceert het verpakken van bacterieel DNA, in plaats van viraal DNA in de faag capside. De meeste van S. aureus isolaten gelysogeniseerd door bacteriofagen 1. Bij stressomstandigheden kan prophages worden uitgesneden uit het bacteriële genoome en verschuiving naar de lytische cyclus.
Dit zijn de drie bekende mechanismen voor DNA overdracht in S. aureus. Er zijn een aantal extra overdrachtmechanismen, zoals "pseudo-transformatie" 2 en faag-achtige systemen op de overdracht van pathogeniteit eilanden 4. Onlangs heeft één groep rapporteerde dat "nanobuisjes" betrokken zijn bij de overdracht van cellulaire materialen (waaronder plasmide-DNA) tussen naburige cellen 5, 6, maar een vervolgonderzoek dusver niet gebleken van andere groepen.
Dit werk zorgt voor de nodige methodologie om HGT studeren in S. aureus door het aanpakken van de drie belangrijkste overdracht trajecten: conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie. De verkregen met deze methoden resultaten werden gebruikt om de overdracht van de cfr-gen (chlooramfenicol / florfenicol weerstand) onderzoek onderS. aureus stammen 7. Deze drie technieken zijn veelzijdig gereedschap voor het onderzoeken van MGE transmissie in S. aureus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk beschrijft de drie belangrijkste methoden om de HGT van genetische determinanten in S. aureus te bestuderen. Hoewel transductie en vervoeging zijn onderzocht voor tientallen jaren, werd het bestaan van natuurlijke transformatie pas onlangs erkend 2. Aldus S. aureus is uitgerust met alle drie belangrijkste takken van HGT en testen allemaal nodig is om de mogelijke verspreiding paden van genetische determinanten verduidelijken. Het doel van dit werk is om volledige …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
References
- Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
- Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
- Caryl, J. A., O’Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
- Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
- Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
- Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
- Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
- Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
- Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically – Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).
- Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
- Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
- Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
- Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
- Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
- Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
- McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
- Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
- Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
