软琼脂覆盖技术使用筛选细菌产生的抑制化合物

1.上清液准备进行测试的活动通过适当的量溶解在无菌的0.1M 硫酸镁缓冲液（ 如 1毫克丝裂霉素C / 2毫升缓冲液）制备丝裂霉素C的0.5毫克/毫升储液。在4℃的避光储存容器股票（丝裂霉素C对光敏感）。 接种丁香假单胞菌的单菌落于3ml国王的培养基B（KB）肉汤14。孵育过夜，在室温下振荡（200rpm）下（21-25℃）。 第二天早上，淡化肉汤培养物的1/100为3毫升新鲜KB肉汤。孵育3-4小时，在室温下摇动。加丝裂霉素C（0.5微克/毫升，最终浓度）。孵育过夜培养在室温下摇动。 注：丝裂霉素C导致双链DNA断裂，从而刺激细胞的SOS反应，导致产生两个噬菌体和细菌素。 粒料1-2毫升丝裂霉素C以20,000 xg离心诱导的培养离心在台式微量离心机5分钟。 除去，要么通过使上清液通过0.22μm孔径的过滤器或通过用氯仿的上清液（每1ml上清液100μl的氯仿）消毒培养上清。 如果使用氯仿，涡旋该混合物15秒，并让在室温下孵育1小时。培养后，离心以20,000 xg离心混合物5分钟。 注：氯仿​​有效地溶解它们的膜杀死细胞。使用氯仿过过滤除菌的好处是，它是便宜和更容易按比例放大，如果在一次处理多个（> 20）的样品。可能有一种可能性，即一给定的杀伤活性丢失以下氯仿处理作为分割的结果到有机相中。 使用1毫升吸移管到新鲜，无菌的1.5或2.0毫升拆下上部，水相离心管。小心不转让任何下层氯仿层（最好是删除较少的水相，以避免结转）。 孵育在通风橱中未加帽的转移的上清液允许残余氯仿蒸发（几个小时）。商店上清在4℃。 2.聚乙二醇（PEG）沉淀高分子量的化合物杀菌法分离和浓缩到无菌上清液，分别加入NaCl和PEG 8000至1 M和10％的最终浓度。反复颠倒样品直到两者NaCl和PEG完全溶解。孵育的样品在冰浴中1小时或过夜，在4℃。 离心样品以16,000 xg离心在4℃下30分钟。粒料应该形成在离心管的底部。倒出上清液并悬浮颗粒在所需的体积（如1/10或原始上清液体积的1/100通过反复移液缓冲液（10mM的Tris，10mM的硫酸镁 ，pH7.0）中的乌梅）。 由两个连续提取用等体积的氯仿除去残留的PEG。 结合氯仿与重悬沉淀，涡旋10到15秒，然后离心混合物以20,000×g离心5分钟。上层水相转移到新的微量离心管中。重复此萃取，直到水相和有机相之间没有白色接口是可见的（通常为2萃取总数）。允许残留的氯仿，以从提取的上清液在通风橱中蒸发。 3.活动覆盖测试上清液的制备接种丁香假单胞菌菌株的单个菌落用于灵敏度测试于3ml的KB，夜孵育过在室温下摇动。 第二天早上，回到淡化文化1/100到新鲜KB。孵育3-4小时，在室温temperatu摇动回覆。 通过高压灭菌的悬浮液0.35-0.7％（重量/体积）在超纯水中琼脂制备无菌水琼脂上。 注：软水琼脂A股可以用微波炉融化和重复使用，新鲜的叠加并不需要为每个实验做好准备。如果水琼脂再利用，这是至关重要的，以确保它完全熔化以下微波处理。如果不是，则覆盖将具有在固化粒状纹理，这将使解释困难。如果发生这种情况，熔融数分钟在微波中比以前完成更长的琼脂。 保持在使用前一个60℃的水浴中熔化软琼脂。使用无菌血清吸管，转印3毫升软琼脂的无菌培养管。返回培养管水浴在熔融状态下保持。 倒覆盖，首先使熔融琼脂冷却（它应该感到温暖，但不烫手），但不允许凝固。 在无菌罩，接种100微升试验菌文化融入到软琼脂，涡旋混合。用手转动培养10-15秒，然后倒到一个底部琼脂（KB琼脂）。倾斜盘，全方位地保证了软琼脂均匀覆盖底部琼脂。 注：底部琼脂可以是任何固化（1.5％琼脂）培养基上的试验菌株蓬勃发展。对于一个标准的100毫米直径的培养皿中，用〜20毫升融化网上平台。底部琼脂（如果保持在4℃下不进行干燥），或者可以在同一天制备可以提前准备好几个星期。如果准备在同一天进行叠加，最好做3.4的步骤之前如此。 覆盖板，并允许它20-30分钟固化。要小心，不要打扰板，同时巩固。 一旦固化，发现2-5微升上清液到覆盖（在部分1和2，上述生成）。允许所述板到夜间在室温下孵育过。观察并在第二天早上创纪录的业绩。 注意：可以是执行并从上清液的系列稀释斑点是有用的。这将使研究人员能够噬菌体和细菌清除活动区别开来。在这种情况下，建议执行1:5或1:10稀释液。