We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
הטכניקה כיסוי רך אגר פותחה במקור לפני למעלה מ -70 שנה ויש בו נעשה שימוש נרחב מספר תחומי מחקר מיקרוביולוגי, כולל עבודה עם ופאג'ים ו bacteriocins, סוכנים אנטיבקטריאלי חלבוניים. גישה זו היא זולה יחסית, עם דרישות משאבים מינימאליות. טכניקה זו מורכב תצפית supernatant מן זן תורם (מחסה פוטנציאל תרכובת רעילה (ים)) על גבי כיסוי אגר רך הקרושה כי הוא זרע עם זן מבחן בקטריאלי (שעשוי להיות רגיש אל התרכובת הרעילה (ים)). ניצלנו בטכניקה זו כדי להקרין ספריה של Pseudomonas syringae זנים להרג intraspecific. על ידי שילוב גישה זו עם צעד ממטר ומחיקות גן ממוקדות, תרכובות רעילות מרובות המיוצרות על ידי הזן הזהה יכולות להיות מובחנות. שני הסוכנים אנטגוניסטית התאוששו בדרך כלל באמצעות טכניקה זו הם ופאג'ים ו bacteriocins. סוכנים שני אלה יכולים להיות מובחנים באמצעותשתי בדיקות נוספות פשוט. ביצוע דילול סדר על supernatant המכיל בקטריופאג יגרום הפלאק בודד אהיה פחות במספרים עם דילול גדול יותר, ואילו דילול סדרה של supernatant המכיל bacteriocin יגרום אזור קרחת הופך אחיד יותר עכור עם דילול גדול יותר. בנוסף, בקטריופאג יפיק אזור סליקה כאשר הבחין על שכבה אגרה רכה טריה זורעת עם הזן הזהה, ואילו bacteriocin לא יצר אזור סליקה כאשר הועבר מדשאה אגרה רכה טריה, בשל הדילול של bacteriocin.
לאחרונה, חלה התעניינות משמעותית להעמקת ההבנה שלנו של אקולוגיה של חיידקים (בעיקר microbiomes של סביבות שונות), כמו גם תרכובות אנטיבקטריאלי חדשות להשתמש במאבק פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה 1,2. נושא מקשר בין האינטרסים אלה הוא הבנת אינטראקציות אנטגוניסטית בין זני חיידקים בסביבתם הטבעית. ישנן דרכים רבות בהן חיידקים להרגיז המתחרים 3. Bacteriocins, קבוצה מגוונת של תרכובות חלבוניים, אנטיבקטריאלי, נחקרו ארוכות על תפקידם בתיווך אנטגוניזם interbacterial, עם שני המינים הנחקרים ביותר להיות Pseudomonas aeruginosa 4,5 ו Escherichia coli 6, פתוגנים אנושיים חשובים. בנוסף bacteriocins, המושרה prophages יכול גם פועלים כסוכני anticompetitor, המאפשר זן לפלוש לתוך נישה כי כבר יישבו 7. Pseudomonas syringae הוא פתוגן צמח ידוע לייצר מערך סוכני מיקרוביאלית, כולל bacteriocins חלבון היחיד 8, נגזרות זנב בקטריופאג bacteriocins 9 (המכונה tailocins), כמו גם מטבוליטים משניים שאינם חלבוניים 10. לאחרונה חלה התעניינות בהבנה כיצד antimicrobials אלה משפיע על האקולוגיה של האורגניזם הזה, כמו גם איך הם יכולים להיות רתומים לשלוט צמח מחלה 11.
שיטת שימוש נרחבת ללימוד הוא bacteriocins ו בקטריופאג היא טכניקת הכיסוי הרכה-אגר. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Gratia בשנת 1936 על מנת לסייע בתהליך ספירת 12,13 bacteriophage.
כאן אנו מתארים את יישום שיטת הכיסוי הרך-אגר, בשילוב עם מניפולציה גנטית ממוקדת פוליאתילן גליקול (PEG) ממטרים, שחר להבחנה בתוך שלושה סוכנים מיקרוביאלית שונים (א בקטריופאג, bact משקל מולקולרי גבוהeriocin, וכן bacteriocin משקל מולקולרי נמוך) המיוצר על ידי זן חיידקים אחד. היתרון של גישה זו הוא כי זה יחסית פשוט וזול, וזו הסיבה, למרות היותו זה בהחלט "לואו-טק", הוא עדיין שימוש נרחב.
טכניקת הכיסוי הרך אגר המתוארת כאן יושמה נרחבת במשך עשרות שנים רבות על ידי חוקרים מעוניינים ופאג'ים או bacteriocins. היתרונות העיקריים של גישה זו הם כי הוא פשוט, זול יחסית קל לפרש. על ידי שילוב של כיסוי רך אגר עם ממטרים PEG ו דילול סדרתי, סוכני מיקרוביאלית ניתן לחלק גבוה לעומת סוכנים משקל מולקולרי נמוך, בשכפול הדנ"א לעומת סוכנים שאינם בשכפול הדנ"א (כלומר בקטריופאג לעומת tailocin, בהתאמה). לבסוף, שילוב של מניפולציה גנטית ממוקדת (מחיקות שלמות) של bacteriocin המשוערת או לוקוסי prophage יכול לקבוע את זהותה בתקיפות של תרכובת נתונה אנטגוניסטית. השתמשנו לאחרונה בשיטה זו כדי לתאר בקטריופאג הנגזרות חדש bacteriocin הרווחת בקרב Pseudomonas syringae זנים 9.
תקשורת הצמיחה ותנאים מצוינים עבודה בפרוטוקול זה גם עבור Pseudomonas סאיםringae ו יספיק סביר עבור חיידקים גראם-שלילי אחרים הגדלים במרץ בתנאים אלה. עם זאת, חוקרים בשיטה זו ירצו לייעל את העיתוי, בינוני התרבות, שיטת אינדוקציה, וטמפרטורת דגירה של המערכת שלהם. הפרמטרים הקריטיים כוללים גרימת התרבות לייצר תוך בשלב צמיחת הלוגריתמים, כמו גם זריעת הכיסוי רך אגר עם תרבות בשלב לוגריתמים מספיק כדי להבטיח חלוקת חיידקים אחידה, אבל לא התרבות יתר, אשר מטשטשת אזורי סליקה פוטנציאליים. ישנם bacteriocins רב שאינם מושרים במסגרת תגובת ה- SOS, אלא הם המושרה באמצעות מערכות חישה קוורום מבוסס פפטיד (במיוחד bacteriocins גראם חיובי 15), ובכך, חוקר אולי כדאי להקרין כמה שיטות אינדוקציה שונות (כגון שינוי תוכן תזונתי של גרימה בינונית, או המאפשרים דגירה ממושכת של זן הייצור).
בעת שימושבטכניקה זו, הכיסוי רך אגר חייב להיות נמס ביסודיות ומתוחזק על 55-60 מעלות צלזיוס לפני התוספת של זן הזריעה. היו לנו כמה בניסויים שבם-אגר הרך לא הותך ביסודיות (אם כי מבחינה ויזואלית זה נראה) וגרם שכבה עם מראה מגורען. תוצאות מ שכבה מגורענת עדיין יכולות להיות וניתנות לפרשנות בדרך כלל, עם זאת, זה תלוי את הכח של העיכוב (עיכוב החלש יהיה קשה יותר כדי לצפות). השתנו סופי, בלבול שיש להביא בחשבון בעת השימוש בטכניקה זו היא שהטמפרטורה של אגר המותך מותרת מספיק זמן להתקרר לפני חיסון עם זן הזריעה, כדי למנוע הרג את מתח הזריעה. כדי למנוע בעיה זו, אנו להבטיח את אגר רך חם, אבל לא חם, לגעת. ברוח דברים אלה, יש לנו גם ציינו כי אם אנחנו נותנים זמן מספיק בשביל תרבות זריעה להסתגל אגרתי המותך, לפני מזיגת הכיסוי, אנחנו מחלצים גרמו חיידקי עניים בדרך כללrowth, מה שהופך פרשנות של עיכוב ספציפי קשה או בלתי אפשרי לפרש. זו הסיבה שאנו מאפשרים 10-15 שניות נוספות של דגירה בין vortexing ושופך השכבה. Trade-off בין השמירה על אגר במצב מותך לחלוטין (חם עדיף) אך לא חשף את מתח הזריעה (חם הוא לא טוב יותר) הוא אחת כי סביר להניח שאתה צריך להיקבע על ידי חוקר באמצעות ניסוי וטעייה.
אם צעד ממטרי PEG משמש, זה יהיה מועיל לכלול שליטה שלילית שבו מדיום מרק סטרילית מעובד זהה supernatant התרבות. פעולה זו תבטיח כי הרג הפעילות אינה תוצאה של PEG שיורית או כלורופורם בתוך supernatant המדגם.
כפי שניהם ופאג'ים ו bacteriocins נוטים להיות מאוד ספציפי, אין זה נדיר להיתקל אין פעילות הרג לכאורה עם שילוב של זנים נתונים. זה יכול לנבוע ממגוון מחדש זן ספציפימנגנוני sistance, אחד להיות כי המתח הבוחן או חסר או יש גרסה לא מוכרת של הקולטן דרושי מיקוד ידי bacteriocin או bacteriophage נתונים.
שיטה חלופית, שיטת הקרנת bacteriocin תוארה על ידי קאוואי et al. , אבל סובל חסרונות ולא אומצה 16 נרחב. באופן ספציפי, טכניקה זו מחייבת התבוננות דגימות מרק במרווחי זמן שיכול להיות מעיק, ואינה מאפשרת לאפליה בין פעילויות הרג בקטריופאג נגזרות bacteriocin הנגזרת.
המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא כי הוא אינו מתאים גם עבור אורגניזמים שאינם גדלים וחסון (ובכך יחסרו אזורי סליקה להבחין בקלות) או כי prophages הנמל או bacteriocins שלא מיוצרים וחסונה בתנאי מעבדה. לאימוצו של הטכניקה הזו כדי לזהות bacteriocins מיוצר דגימות סביבתיות הן ירחיב את תוכנית השירותבטכניקה זו ולהקל להבין טוב יותר את התפקיד של bacteriocins בתוך סביבה טבעית.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |