عزل وتوصيف Microvesicles من الدم المحيطي
Summary
Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.
Abstract
الافراج عن حويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية) بما في ذلك exosomes صغيرة المستمدة endosomal (Exos، قطرها <100 نانومتر) والبلازما كبير microvesicles المشتقة من غشاء (MVS، قطر> 100 نانومتر) هو عملية الخلوية الأساسية التي تحدث في جميع الخلايا الحية. وقد أبرزت هذه البروتينات حويصلات النقل، والدهون والأحماض النووية محددة لخلايا المنشأ وفي الدراسات المختبرية أهميتها وسطاء من الاتصالات بين الخلايا. وقد تم عزل المركبات الكهربائية بنجاح من مختلف سوائل الجسم وتم التعرف خصوصا المركبات الكهربائية في الدم واعدة المؤشرات الحيوية لمرض السرطان أو أمراض المعدية. من أجل السماح للدراسة القطعان MV في الدم، نقدم بروتوكول لعزل موحدة وتوصيف MVS من عينات الدم الطرفية. ومكعبات MVS من عينات البلازما anticoagulated EDTA بواسطة الطرد المركزي التفاضلي وتمتلك عادة يبلغ قطرها 100-600 نانومتر. نظرا لحجم أكبر، فإنها يمكنبسهولة دراستها من قبل التدفق الخلوي، وهي تقنية تستخدم بشكل روتيني في التشخيص السريري ومتوفرة في معظم المختبرات. سيتم إعطاء العديد من الأمثلة لفحوصات مراقبة الجودة من MVS معزولة وستعرض علامات التي يمكن استخدامها للتمييز من القطعان MV مختلفة في الدم.
Introduction
في السنوات الأخيرة أثبتت العديد من الدراسات المختبرية أن الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية) تلعب دورا هاما في التواصل بين الخلايا. الخلايا الحية تسليط باستمرار الحويصلات والتي تختلف في الحجم والمحتوى ونشوء حيوي. والمركبات الكهربائية أفضل درس هي exosomes التي تنشأ من نظام endosomal حيث يتم تخزينها كما حويصلات داخل اللمعة في الهيئات عديد الحويصلات. مرة واحدة فتيل الأخير مع غشاء البلازما، ويتم الإفراج عن الحويصلات كما وردت exosomes (Exos، قطرها 30-100 نانومتر 1). عدد سكانها الثاني من EV التي اكتسبت اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة وmicrovesicles كبيرة (MVS، قطرها 100 – 1000 نانومتر) التي برعم خارج مباشرة من غشاء البلازما 2.
وتحيط كلا النوعين من الحويصلات التي كتبها طبقة ثنائية الدهون ويحتوي على الأحماض النووية، على سبيل المثال، الحمض النووي، ومرنا أو ميرنا 3-5، وعدد كبير من البروتينات التي يمكن نقلها إلى ج المجاورةملتعلمي اللغة اإلنكليزية. بينما في عام تكوين البروتين من الحويصلات يعكس حالة من الخلية الأصلية، ويبدو أن بعض البروتينات لتكون مستهدفة بشكل انتقائي وأثرت على المركبات الكهربائية 1. والفائدة بحثية رئيسية هي تميز المركبات الكهربائية من الخلايا الشاذة والمريضة من أجل تحديد التوقيعات EV المحددة التي قد تسمح باستخدام المركبات الكهربائية والمؤشرات الحيوية الجديدة. وخصوصا في سرطان، والذي غالبا ما يكون الورم نفسه لا يمكن الوصول إليه بسهولة، الخزعات السائلة التي تستهدف المركبات الكهربائية للورم معين في الدم قد يسمح برصد ردود العلاج أو المساعدة تميز الورم الرئيسي دون الحاجة إلى إجراءات الغازية 6.
في الواقع، وقد تم بالفعل عزل المركبات الكهربائية بنجاح من سوائل الجسم المختلفة بما في ذلك البول 7، 8 CSF، حليب الثدي 9 أو الدم 10. حددت العديد من الدراسات التغييرات في التهم EV والتكوين في الأمراض البشرية المختلفة. على سبيل المثال، في المرضى الذين يعانون الإنتان عدد MVS المساعد على حدوث تخثر هوزيادة كبيرة مقارنة مع الأفراد الأصحاء 11. أيضا في المرضى الذين يعانون من الملاريا الدماغية الشديدة زيادة في مجموع MVS في الدم ويمكن ملاحظة وتهم MVS المشتقة من الصفائح الدموية ترتبط مع عمق الغيبوبة ونقص الصفيحات 12. دراسات أخرى تفيد أرقام مرتفعة من الحويصلات المشتقة من البطانة في المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية أو فشل القلب وفي الحالة الأخيرة، وهذا يرتبط مع احتمال أكبر للأحداث القلب والأوعية الدموية 13،14.
خصوصا في السرطان، وتناقش المركبات الكهربائية في الدم حاليا منصب المؤشرات الحيوية الرواية مع القيمة التشخيصية والنذير. ويبدو أن مستويات MVS معربا عن البروتينات المرتبطة الورم مثل MUC1، EGFR أو FAK لتكون مرتفعة في الدم لمرضى سرطان الثدي 15،16. أيضا لExos، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن Exos المشتقة من الدم تحمل مستضدات الأورام محددة مثل Glypican-1 لسرطان البنكرياس أو ديل-1 للكشف عن سرطان الثدي في وقت مبكر يسمح المرض دياحلماية مع خصوصية عالية وحساسية 17،18. بالإضافة إلى ذلك، قد الورم المشتقة من الدم Exos يحتوي على الحمض النووي التي يمكن استخدامها للكشف عن الطفرات مثل KRAS والبروتين p53 مما يوحي استخدامها للتنبؤ العلاج 19. وقد أظهرت التطورات الأخيرة أن تحليل Exos في الدم لمرضى ورم أرومي باستخدام رقاقة ميكروفلويديك محدد يسمح رصد العلاج 20. معا، وهذه النتائج تعني أن تحليل القطعان بأمراض محددة من الحويصلات يعطي معلومات قيمة عن التشخيص، والتشخيص، وكذلك الخيارات العلاجية والنجاح.
ومع ذلك، والعزلة وتحليل Exos من الدم تستغرق وقتا طويلا، ويتطلب معدات المختبرات الخاصة وبالتالي فهي ليست مناسبة لتشخيص السريرية الروتينية حتى الان. في المقابل، MVS يمكن عزل أسرع بكثير، ونظرا لحجم أكبر، ويمكن تحليلها بسهولة عن طريق التدفق الخلوي دون الحاجة لزوجين لهم حبات اللاتكس بقدر ما هو ضروري لExos 1821. وهكذا، وهنا نقدم بروتوكول التي يمكن استخدامها لعزل موحدة للMVS من عينات الدم وتوصيف لاحق من القطعان MV التدفق الخلوي. سوف يسمح هذا البروتوكول مزيد من الدراسة وفي عمق توصيف ملامح MV في مجموعات المرضى الكبيرة التي سوف تكون هناك حاجة لاستخدام MVS عن التشخيص السريري اليومية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أثبتت الدراسات الحديثة في المركبات الكهربائية في الدم الذي تكوين EV وتعول تتغير خلال ظهور العديد من الأمراض. ولذلك، فإن تحليل وتوصيف مزيد من هذه المركبات الكهربائية ذات فائدة عالية لمواصلة تقييم استخدامها المحتمل والمؤشرات الحيوية المرض التشخيص والتشخيص أو لتقييم الاستجابات العلاج. بروتوكول نقدم هنا يسمح للعزلة الحويصلات التي يبلغ قطرها يصل إلى 600 نانومتر والتي لا تحتوي على أي عضيات الخلية. هذه الملاحظات تتفق مع التعريف الحالي للMVS وشاملة وجود الهيئات أفكارك 2. باستخدام الغربية التنشيف، كنا قادرين على إثبات أن MVS معزولة تظهر تعبير عال من تويولين، في حين أن tetraspanins CD9 وCD81 التي غالبا ما تستخدم كعلامات إكسو وأعرب إلا قليلا. وهذا يؤكد أن MVS تختلف من Exos ويناسب مؤخرا توصيف معمقة ومقارنة كل من السكان EV من البروتينات 25.
محتوى "> وخلال الحصول على عينات الدم، فإنه أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوقت بين بزل الوريد وإعداد البلازما قصيرة قدر الإمكان من أجل منع تدهور MV. وعلاوة على ذلك، يمكن التخزين لفترات طويلة من عينات الدم يؤدي إلى تنشيط خلايا الدم يسبب تعزيز MV وذرف وموت الخلايا المبرمج الذي يؤدي إلى الإفراج عن الهيئات أفكارك في نهاية المطاف. هناك اعتبار آخر مهم لMV العزلة هو لمنع التلوث من الاستعدادات MV مع بروتينات البلازما أو Exos أصغر. ولذلك، من المهم جدا لإزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن بعد الغزل أسفل وMVS في 14000 ز س منذ بيليه هو عادة مرئية وتعلق بإحكام على جدار الأنبوب، طاف يمكن إزالتها بسهولة مع طرف ماصة. وعلى النقيض من Exos التي تميل إلى تشكيل المجاميع أثناء إعداد بالسرعة العالية تنبيذ فائق و في كثير من الأحيان من الصعب ل resuspend، لا تحدث هذه المشكلة مع MVS.أظهرت دراستنا أنه possiبلي لتوصيف القطعان MV الموجودة في الدم عن طريق التدفق الخلوي. على الرغم من أن الحد الكشف عن معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي حوالي 200-300 نانومتر، تم قياس MVS بتكاثر في المانحة وكذلك عينات ثقافة الخلية مع نفس المعلمات من التحليل والبوابات التي يسمح بوضوح تميزهم من الإشارات الخلفية. فمن المهم للتحقق من قبل القياسات أن برنامج تلفزيوني المستخدمة في تحليلات لا يحتوي على أي جزيئات الملوثة التي يمكن أن تسبب خلفية عالية خلال التدفق الخلوي (الشكل 3). على الرغم من أن بعض MVS أصغر قد لا يتم القبض في نهج تدفق cytometric، اكتشفنا MVS من جميع السكان خلايا الدم الرئيسي (على سبيل المثال، الصفائح الدموية وخلايا الدم الحمراء، كريات الدم البيضاء، والخلايا البطانية). في تحليلاتنا استخدمنا علامات قياسية لخلايا الدم المختلفة التي تم العثور عليها سابقا على MVS 26-29. وتجدر الإشارة إلى أنه من أجل الحصول على أفضل النتائج الممكنة عن طريق التدفق الخلوي، رانه يرقى، وينبغي معاير تركيز كل الأجسام المضادة على عينة MV معربا عن مستضد من الفائدة. إذا يجب أن تبين القطعان MV محددة في الدم مع ارتفاع خصوصية، فمن الممكن أن تؤدي تلطيخ مزدوج ضد اثنين من مستضدات مختلفة موجودة على MVS منها والنظر فقط عن MVS إيجابي مزدوج لالتحليلات اللاحقة 23. حاليا، هناك جهود لتحديد نطاق قياسي من القطعان MV في الدم من الأشخاص الأصحاء 23،30. وقد أظهرت هذه الدراسات بالفعل أن MVS المشتقة من الصفائح الدموية تشكل أكبر عدد من MVS في الدم والتي هي في المراسلات مع ملاحظاتنا.
ميزة واحدة من التدفق الخلوي لتوصيف عينات MV هي أن هذا الأسلوب بالفعل راسخة لأغراض التشخيص في معظم المراكز الطبية التي من شأنها أن تسمح للاستفادة ممكنة من MVS والمؤشرات الحيوية في التشخيص السريري اليومية. الدراسات السابقة على المركبات الكهربائية في الدم الذي يكون في الغالب التركيزإد على Exos أصغر، والاعتماد على أي إجراءات الفرز محددة لتحليل انتقائي المطلوب السكان المستهدفين إكسو 31،32 أو تتطلب (2 أيام) عملية عزل تستغرق وقتا طويلا مع اقتران Exos لاللاتكس الخرز السابقة للتحليل 18. وتشير ملاحظاتنا غير منشورة الخاصة أن تحليل تدفق cytometric من MVS من الاستعدادات الدم كلها حتى يسمح للكشف عن MVS مثل MVS المستمدة من الورم دون أي عمليات الاختيار هذه.
معا، وبروتوكول المعروضة هنا يسمح للعزلة سريعة من MVS من عينات الدم الطرفية مع معدات المختبرات القياسية والتوصيف لاحقا باستخدام التدفق الخلوي والتنشيف الغربية. العملية برمتها لا يمكن أن يؤديها في حوالي 2 ساعة مما يسهل الدراسات المستقبلية على ملامح MV في الدم المرضى المطلوبة لتقييم إمكانات MVS كما المؤشرات الحيوية المرض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).
Materials
| butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
| For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
| CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5µl for staining |
| CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5µl for staining |
| CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8µg for staining |
| CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1µg for staining |
| CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
| ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56°C) |
| filter 0.22µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| 4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
| microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
| milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
| multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
| PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
| perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
| Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
| rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
| rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
| tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
| tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
| tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
| Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5000 in 5%BSA in TBST |
| ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
| ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
| valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, (2015).
- Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
- Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
- Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
- Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
- Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
- Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
- Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
- Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
- Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
- Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
- Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
- Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
- Moon, P. -. G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
- Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
- Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
- Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
- Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
- Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
- Rupp, A. -. K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
