세포 유래 세포 외 매트릭스의 빠른, 분리, 기능 연구에 대한 확장 방법, 및 분석
Summary
The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.
Abstract
The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.
Introduction
지난 몇 년 동안, 세포 외 기질 (ECM)는 여러 세포 생리 학적 및 병리학 적 과정에 관여하는 다양한 동적, 복잡한 환경으로 인식되고있다. 조직 수준에서 ECM은 세포 신호, 운동, 분화, 혈관 신생, 줄기 세포 생물학, 종양, 섬유화 등 1, 2에 영향을 미친다. ECM 조직 및 ECM에 의존하는 프로세스의 연구는 따라서 세포 생물학 및 조직 생리에 대한 폭 넓은 의미를 가지고있다. ECM 구성, 조직 및 기능적 특성의 기계적인 이해에 도달하기 위해 ECM의 정확한 분리를위한 방법이 필요합니다. 조직 (3)로부터 분리 의존 ECM 단백질의 초기 식별하는 반면, 배양 된 세포로부터의 ECM의 제조는 더욱 보급되고있다.
세포 유래 ECM의 분리 및 분석은 두 가지 이유로 복잡하다. 우선, 세포의 존재 및IR 풍부한 세포 단백질 어려운 개별 세포 구조와 ECM을 분리 할 수있다. 실제로, 몇몇 ECM 단백질은 세포 내부뿐만 아니라 ECM (4) 역할을; 전자 재료 내의 단백질의 연구는 세포 내부의 역할과 혼동 될 수없는 경우, 따라서, 세포 유래의 세포 ECM 단백질의 효과적인 제거가 필수적이다. 둘째, 세포 유래 ECM 종종 공유 가교 ECM 조립체에있는 표준에 따라서 세제 불용성 많은 대형 올리고머 단백질로 구성된다. 이러한 속성은 추출 및 ECM의 추가 분석을 복잡하게 할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 방법은 세포 성분으로부터 ECM 단백질의 효과적인 분리를 가능하게 할 필요가있다.
여러 방법은 세포 배양 또는 조직 추출물 중 ECM으로부터의 분리에 대한 문헌에 기술되어있다. 이러한 방법의 대부분은 풍부한 ECM 홍보의 추출을 목표로하고 있습니다otein는 조직으로부터 콜라겐 및 중성 염 (3) 산성 조건 5,6- 또는 펩신 (7)의 사용을 포함한다. 조직 추출물에서 총 ECM의 분리는 종종 전에 ECM의 분리에 조직의 탈세 포화을 포함한다. 예를 들어, 연속 추출 방법은 인간의 심장 조직 (8)로부터 분리하는 ECM을 설명 하였다. 우선, 느슨하게 결합 된 ECM 단백질은 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 전에 0.5 M NaCl로 추출 된 세포를 제거 하였다. 마지막으로, 나머지 ECM 단백질은 4 M 구아니딘 (8)를 이용하여 추출 하였다. ECM은 8 M 요소 (9)를 사용하여 decellularized 샘플에서 용해 될 수있다. 다른 기술은 원심 분리하여 수용성 세포 용 해물로부터 불용성 ECM 단백질을 분리하기 전에 두 세포 및 ECM을 추출 등 옥시 콜산 10 세제를 사용한다.
격리이 보고서에 기술 된 세포 유래 ECM의 분석 방법은 생식을 제공합니다세포 물질을 제거 시츄 면역 형광에 의해 분석이나 생화학 분석을 위해 추가로 추출 될 수있는 세포 – 유래 ECM을 떠나는 ducible 방법. 이 방법은 어떤 자기편 세포 유형에 적용 할 수 있습니다 및 면역 또는 질량 분석, 또는 기능 연구에서 분리 된 ECM의 활용 등 다운 스트림 절차를 위해 확장 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 실시간으로 관심 태그 ECM 단백질의 침착을 추적하는 생균의 공 초점 현미경과 함께 사용될 수있다. 이것은 격자, 유리 바닥 접시의 사용을 통해 달성된다. 전체적으로, 방법은 세포 유래 ECM도 식별 증착 개별 ECM 단백질의 동력학을 모니터하는 범위의 정확한 분리를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
이 방법은 ECM의 성공적인 분리 및 분석을 위해 따라야하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 예를 들어, 수산화 암모늄이 세포를 제거하고, 분석 ECM을 분리하는데 사용된다. 수산화 암모늄은 어둠 수용액에서 안정하고, 실온에서 저장 될 수 있지만, 각각의 병은 단단히 사용 사이를 다시 밀봉한다. 가스 따라서 농도를 감소시켜 용액으로부터 증발 할 수 있기 때문에, 강하게 신선한 병마다 6~8주 시작 추천한다. 또한, 상기 작업 용액을 각각의 실험에 갓한다. 이는 세포가 완전히 탈 이온수에 풍부한 세척 제거되는 것이 필수적이다. 이 단계를 적절하게 수행하지 않는 경우, 세포 물질은 접시에 남아 및 다운 스트림 분석을 오염시킬 수 있습니다. 세포를 10 일 이상 성장 된 경우, 추가의 물 세척이 필요할 수있다. 그것은 n은 중요하다촬상시 ECM을 식별 할 때는주의가 필요하므로 ECM 절연 층은 일반적으로 셀 (11)에 비해 매우 얇고 OTE. SDS-PAGE 샘플 버퍼에 절연 ECM의 효율적인 추출을 위해, 샘플 버퍼는 환원제를 포함하는 것이 필수적이다. 전자 재료의 효과적인 제거를 위해 끓는 핫 샘플 버퍼가 사용되어야한다. ECM 샘플은 단백질 염색 또는 프로테오믹스 대한 SDS-PAGE 전기 영동에 의해 해결 될 것이다 실험을 위해, 샘플 버퍼 동일한 분취 량으로 ECM 여러 플레이트 가치를 스크랩하여 농축 샘플을 얻기 위해 중요하다.
수정 및 문제 해결
ECM 단백질의 생산과 분비는 세포 유형 사이에서 크게 달라질 수 있으므로, ECM의 분비 및 증착의 시간주기는 각각의 세포 유형에 대해 새로이 결정되어야한다. ECM 조성물 관계 t에 동적으로 변경된다는 점에 유의하는 것도 중요하다문화 18 오 세포 밀도 및 시간입니다. 실험 설계시 이러한 요인을 고려해야한다. 총 ECM 단백질의 상당한 양이 필요할 수 질량 분석법에 의해 분석 ECM을 추출 할 때 특히 명백하게,이 방법을위한 세포 유형의 선택이 중요하다.
기술의 한계
ECM 단백질의 매우 낮은 수준을 분비 세포는이 방법을 사용하기에 더 도전 할 것이다. 비 부착 세포, 3D 세포 배양, 또는 셀 침공 분석이 방법으로 ECM 격리를위한 현재 부적합하다. 이 방법은 표준 "2 차원"세포 배양에 사용하기에 가장 적합하다. 암모늄 수산화물 추출 완전히 ECM 셀의 상부면에 결합되고 분비 세포를 제거하지만, 비 – 교차 결합되기 때문에, ECM 단백질은 또한 아래에서 상기베이스의 주위 접시에 조립 ECM의 얇은 층을 남겨 제거 세포 (11, 17)의 </> SUP. 이는 방출 된 재료는 종래 분비 또는 세포 표면에서 흡수 이후에 세포이다 ECM 단백질을 포함하므로, 암모늄 히드 록 시드를 추출하여 해제 얼마나 ECM 정량화 복잡하다.
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
절연 ECM 실험의 넓은 범위를 수행하는 능력은 세포 생물학, 조직 생리 맥락에서 중요하고, 또한, 조직 재생 및 조직 공학 분야에 대한 의미를 가진다. 상기 방법은 세포가 천연 가교 메커니즘과 기원의 세포 유형에 적합한 비율로 존재하는 각각의 ECM 단백질과, 그 나라의 크기 복잡한 ECM 구조를 조립하는 정제 된 콜라겐이나 정제 된 ECM 단백질로부터 형성된 겔에 비해 많은 장점을 갖는다. 예상 예를 들어, RCS ECM의 단백체 연구는 풍부한 matrilins 및 COMP / TSP5을 보여 주었다연골 ECM (19, 20) (그림 4). 일반적으로, 세포 유래 ECM의 분석은 공유 결합 가교를 초래 광범위한 다중 단백질 네트워크 많은 ECM 단백질의 불용성로서의 성질에 의해 방해되고, 또한, ECM의 잠재적 오염에 의해 세포 내 단백질 추출한다. 프로테옴 분석을위한 조직으로부터의 ECM 분획을 분리하기위한 다단계 절차 21 식별 된 단백질의 전체 세트 ECM 단백질의 8 %를 수득 하였다. 그러나, ECM 단백질의 펩티드는 확인 된 총 펩티드의 73 %였다. 세포 유래 ECM의 분리 및 분석 방법이 신속하고 안정적으로 ECM 단백질을 유지하는 동안 세포 물질을 제거한다. 이 방법은 세포 유형 하류 다양한 애플리케이션에 사용하고 세포 배양에 ECM 생물학 및 세포 ECM 상호 작용의 분석을 용이하게 할 수있다. 상기 방법은 서로 다른 스케일에 적용될 수 있는지 우리 프로토콜 세부 EXP 다양한를 해결ECM 조직, 역학, 또는 조성물에 관한 erimental 질문과 세포에 고립 된 ECM의 기능적 효과.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
미래를 찾고, 상기 방법은 3 차원 세포 배양에 사용하도록 구성 될 수있다; 이 생리 학적 관련성을 확장합니다. Decellularized 기본 조직이 손실되거나 손상된 조직의 재생 및 심장 장애 (22) 이후로 이식의 대안 등의 발판으로 큰 잠재력을 가지고있다. 이 도너 가용성 및 면역 거부의 문제점을 극복 할 수있는 잠재력이있다. 이 보고서에 기재 한 방법의 미래 애플리케이션은 또한이 방법의 범위를 증가 3D 세포 배양 또는 조직의 탈세 포화와 함께 사용을 조사 할 수있다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 RCS의 ECM의 단백질 체학 분석을 수행하기위한 박사 벨린다 윌러드, 단백질 체학 및 대사 체학 연구소, 러너 연구소, 클리블랜드 클리닉에 가장 감사하고 있습니다. 우리는 JCA에, 번호 K018043을 부여 theMedical 연구위원회 영국의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 hr |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 hr |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 hr |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50000 for 1 hr |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100000 for 1 hr |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28% – 30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16 % solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2 % (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2 % (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot |
References
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