ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡
Summary
This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
Abstract
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Introduction
単一細胞は器官分化と増殖の間にどのように動作するかを理解所の開発における重要な問題の一つがあります。理想的には、遺伝子発現パターンと細胞内のタンパク質の局在化のような細胞事象は、組織のより大きな文脈に照らして見ることができます。この目的は、技術的な課題を提起し、高い空間だけでなく、光毒性作用を引き起こす可能性があり、長期間にわたって時間分解能で全臓器の観察を必要とします。植物はすぐに環境の変化に適応するので、成長条件を厳密に制御しなければなりません。植物の生理学的状態に干渉することなく、長期的画像化を行うために、三つの試料室内に、1）成長条件を確保しなければならない、2）安定した長期間にわたって実装サンプル、および3）イメージング低光強度で光損傷および非生理的条件を避けるために。
生理的成長conditi顕微鏡試料室におけるアドオンは、長期の実験のために重要です。 3 –共焦点顕微鏡1のためのイメージング成長チャンバーを記述する利用可能なプロトコルの数があります。しかし、共焦点顕微鏡は、ストレス反応を引き起こす可能性が植物に高い光強度を紹介し、通常4増殖を阻害します。また、ほとんどの従来の顕微鏡は、彼らが自分自身を再配向し、重力のベクトルに向かって成長しようとするので、植物には最適ではないサンプルの唯一の水平方向の位置を、可能にします。 9 –過去10年間で、光シート顕微鏡は、数日から5までの期間のための細胞の解像度で大標本の開発をキャプチャするための強力なツールとして浮上しています。ライトシート顕微鏡は、垂直方向に試料を配置することができますし、ますます10根の発達を研究する植物の研究に使用されている–最近、ベルテによってレビュー21、トンとMaizel 22。上記の研究10,13の多く– 18,21-は、ゲル17の表面に根を成長させることによって特徴付け実装サンプルの特別な方法を採用したエルンストHK Stelzerの実験室に最適化され、実施されました。これらの研究では、特注の顕微鏡た植物を下から保持され、使用されました。これとは対照的に、広く利用可能な光シート顕微鏡の大部分は上部からのサンプルを保持します。したがって、この特定の調製方法を容易に適用することができません。ここで紹介する方法はOpenSPIM 23、選択平面照明顕微鏡（SPIM）を適用し、強化するためのオープンアクセスプラットフォームに適用可能な十分に確立された上で、表面実装方法のためのプロトコルを提供します。
このプロトコルの全体的な目標は、OpenSPIM光シート顕微鏡でシロイヌナズナの根の長期的なイメージングを可能にすることです。これは、複数の直立した植物を成長させることによって達成されます液体培地にルーツを持つゲルのurface葉は空気中のまま。植物の光合成活動を確保するために、カスタムメイドの照明システムは、葉ではなく、根（ 図1）を照明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
光シート蛍光顕微鏡は、低毒性及び生理学的状態で試料を保持したまま、高時空間解像度で大容量をキャプチャするために使用することができる超高速取得速度を、結合する大きな利点を有します。光シート顕微鏡の解像度は、共焦点顕微鏡9のそれと比較することができます。しかし、光の散乱や吸収が個別に励起および放出経路に沿って発生し、全体的な画質は、表面に比べて不透明な組織内部の有意に低いことができます。この合併症を回避するために1は、垂直軸に沿ってサンプルを回転させ、異なる方向から同じボリュームを観察する可能性を使用することができます。しかし、これは必ずしも有利ではない、 例えば側根は、より多くの情報を得ることなく、低画質の結果後ろから根およびイメージングの一方の側に現れます。しかしながら、回転は、主SAMPを正確に位置決めすることができます最良の方法でル。対物レンズの古典的な水平方向の配置は、サンプル実装の新しい方法を可能にします。植物が垂直位置から利益を得ます。ここで紹介する、「ゲルの表面上の「実装方法は、このようなゲル24,25の内側に根を埋め込むなど、他の取り付け方法に比べていくつかの利点があります。 1）根系は、液体媒体と直接接触しています。試料室は、連続的に新鮮な培地を提供する灌流システムに接続されています。また、急速に、異なる媒体または薬剤を適用するために、サンプルチャンバの全体積を交換するために使用することができます。彼らは実験室で成長させるために使用される2）前準備植物が成長サンプリングします。植物は、蛍光顕微鏡下で選択することができ、唯一の希望植物が用意する必要があります。 3）植物がタッチされることなく、シャーレから試料保持部に転送されます。これにより、植物は、さらに、それが成長incubato中に成長していた同じゲル上で開発することができますrおよび機械的ストレスが最小限に低減されます。 4）試料上の図は、サンプルと検出目的との間の空間は、単に屈折率が異なる媒質なし他の材料で充填されているため、遮るもののない、光収差が最小になります。
長期的イメージングを行うために、植物の照明システムは、植物の光合成活動を確保する必要があります。ほとんどの研究室では植物は根が光にさらされている。すなわち 、透明なゲルに成長します。これは、自分の環境に対して異なる応答を引き起こし、それらの生化学および開発26,27の変化を誘導することができます。根系の光の量を低減するために、黒いプラスチック箔を水表面を覆うために使用されるだけでなく、黒色アルミニウム箔製の蓋は、サンプルチャンバをカバーしました。植物に達することができる光は、蓋内の中央穴を通って出ます。この設定では、背景光の増加は、suggestinを認められませんでした赤色および青色LEDからの迷光の量が有意にGFPフィルター及び遮光アプローチによって減少したG。この光は、カメラのバックグラウンドノイズを増加させることなく、画像収集中にオンに保つことができました。
サンプルホルダーは、3D印刷のために設計されています。試験されたいくつかのプラスチックは、試料のドリフトで、その結果、100％安定していなかったとしてしかし、材料の選択が重要です。したがって、代わりに樹脂を使用するか、またはポリエチレン（PEP）ロッドを粉砕することにより、試料ホルダーを構築することをお勧めします。両面照明システムの光シート顕微鏡セットアップを使用する場合、試料ホルダは、回転角度に応じて光シートの干渉する可能性があります。プレートから植物をすくう時の機械的ストレスを低減するために、スパチュラの平らな角度を使用します。植物はすぐに乾燥して、非常に最初の時間のための空気の流れを体験することができます。ヲ、任意の風（急速な運動、エアコンの流れ）を避けるようにしてください可能な限りrkが途切れ1,000μLのピペットチップ内に試料ホルダーをスライドさせます。顕微鏡の内部では、液体でプラント全体を浸し、乾燥した葉を保持しないことが重要です。
技術は、側根形成の初期段階を撮像するための理想的です。成熟した根の先端の長期撮影を行う場合には1は、シロイヌナズナの根が視野の外に急速に、100〜300ミクロン/時間と一緒に成長することを心に留めておく必要があります。非常に便利な将来の実装では、長期間にわたって、次の根の先端成長を可能にする自動化された追跡アルゴリズムである可能性があります。取得プロセスの間に、光媒体の栄養組成物などの環境条件を制御する能力は、植物は、変化に適応する方法を検討可能にします。ルートは、デキサメタゾン誘導性28またはβ-ESTRを使用して、例えば、化学的に遺伝子発現を活性化する薬剤を適用するために使用することができる液体媒体と直接接触します誘導システム29を adiol。しかし、それは、薬物を洗い流すために試料室の容積全体を交換するために時間がかかります。セットアップは、培地交換を促進するために試料室の容積を最小化することによって改善することができます。それにもかかわらず、この技術は、大きな可能性を秘めています。光シート顕微鏡を用いた実装手順、標準化された生育条件と穏やかな画像取得の組み合わせは、生理的なレベルでの高解像度で、植物の開発の長期的な研究を可能にします。これは、研究者は、植物の開発の基本的なメカニズムを探求するのに役立ちます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、オーディオ機器のための重要な読書/視聴のためにマーチャーシュFendrychとステファンStadlbauerに感謝します。 OpenSPIMへの貢献のためのISTオーストリアでMIBAマシンショップに感謝します。これらの結果につながる研究がREAグラント合意N°[291734]と欧州研究評議会（プロジェクトERC-2011の下で、欧州連合（EU）のセブンス枠組み計画（FP7 / 2007-2013年）の人々プログラム（マリー・キュリー・アクション）から資金提供を受けています-StG-20101109-PSDP）。
Materials
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
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