Summary

Капиллярных фидерных Анализ мер по обеспечению продовольственной приема внутрь<em> Дрозофилы</em

Published: March 17, 2017
doi:

Summary

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Abstract

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

Introduction

Питание имеет важное значение; Тем не менее, дерегулирование приема пищи , что приводит к расстройствами пищевого поведения , такие как булимия, анорексия или общей тенденции к переедать требует затрат на отдельных людей и общества в целом 1, 2, 3. Цель настоящего исследования заключается в раскрытии механизмов регуляции потребления пищи и обеспечить стратегию обхода образование расстройства. Многочисленные исследования с использованием модельных организмов млекопитающих обеспечили новые проникновения в суть схемы и роли сигнальных систем в расстройств пищевого поведения 4, 5, 6. Тем не менее, наши знания о нейронных и молекулярных основ, лежащих в основе этих нарушений остается далека от завершения. В последние годы плодовой мушки дрозофилы стал ценным модельной системой для распутывания основных механистических понимание регуляции metabolisм 7, 8, 9. Капилляра Feeder (CAFE) тест для дрозофилы был создан в лаборатории Сеймура Бензером в 2007 году , вдохновленный более ранней работе Dethier в Blowfly 10, 11. Анализ КАФЕ позволило непосредственно измерить потребление пищи в дрозофилы. В этой поведенческой тестовой системе, мухи питаются жидкой пищей, представленной в градуированных стеклянных капилляров, помещенных внутри флакона. Снижение капиллярной мениска указывает на потерю раствора пищи через испарение и потребление продуктов питания. Определение скорости испарения по флаконах без мух позволяет точно количественно оценить потребление пищи.

Анализ CAFE является одним из нескольких поведенческих парадигм , используемых для измерения кормления в дрозофилы и исследователи должны выбрать наиболее подходящий для их конкретныхвопрос. Решение об использовании определенного анализа следует учитывать следующие моменты: характер пищи при условии; условие кормления; измерение потребления или поглощение питательных веществ и потребления продуктов питания по расследованию или ответ на питание.

Анализ CAFE, как описано в настоящем докладе, идеально подходит для приема пищи следующие жидкого источника питания при вертикальном состоянии питания. В качестве альтернативы прием пищи может быть измерена для летучей группы на цветном источника питания во флаконе или на тарелку. Мухи, как правило, погибают или под наркозом после кормления и количество съеденной красителя определяется с помощью спектрофотометрии или визуального осмотра окрашенном живота. Мухи начинают экскретировать съеденной пищи только через 30 минут после приема, поэтому такой подход трудно использовать для анализа непрерывного длительного кормления поведения , 12, 13.

В отличие от мух сохраняются при рассасывающиеся красителяс с радиоактивной метки используются и их потребление радиоизотопом оценивается в сцинтилляционном счетчике 14, 15. Поглощение радиоактивной системой муха пищеварительном делает возможным долгосрочное измерение поглощения пищи, но может привести к недооценке потребления из-за непоглощаемой и выводится из организма молекул трассеров. Другой подход для измерения реакции на продукты питания в дрозофилы является ответом расширение хоботок (PER), который обычно имеет место для приема пищи 16. Этот элегантный метод измеряет первоначальный ответ на пищевой стимул, но не записывает количество потребления. Прием пищи динамически изменяется во время кормления с использованием нескольких пост-пищеварительные сигналы обратной связи , которые имеют решающее значение для регулирования подачи 17, 18. Несколько попыток было сделано в последние годы для сбора данных полуавтомат в анализе PER <sдо класса = "внешние ссылки"> 19, 20. ПЕР детектируется электрической шлифовальной шкурки или комбинации электродов и подсчитаны с помощью компьютера. Сочетание анализа PER с поглощением радиоизотопов показали , что этот анализ ограничивается низкой чувствительностью к обнаружению количества кормления различий 18. Анализ ручной подачи (Mafe) 21, в котором муха подается вручную с стеклянного капилляра, недавно был разработан для измерения поглощения пищи в одной иммобилизованной муха. Анализ Mafe устраняет помехи поиска пищи и кормления инициацию и имеет разрешение по времени в секундах, а также инициирование PER и потребление пищи может контролироваться независимо друг от друга в анализе. Тем не менее, путь , в котором иммобилизация лету затрагивает некоторые аспекты пищевого поведения (например , локомоции, мотивация) по- прежнему должна быть исследована. Для получения отличных сравнительных обзоров различных анализов для измерения потребления пищи у дрозофилы меняlanogaster и помочь исследователям найти наиболее подходящий, просматривать отчеты по Дешпанде и Маркса 13, 22.

Анализ КАФЕ позволяет избежать некоторых недостатков других анализов, описанных выше, и сочетает в себе простоту использования с надежного измерения потребления пищи. Здесь приводится подробное описание анализа CAFE обеспечивается, и мы покажем простой модификации установки, чтобы уменьшить испарение. Типичные результаты анализа, включая два пищевого выбора (краткосрочной и долгосрочной), а также поглощение сахарозы мух демонстрируется. В ходе обсуждения мы сравним наш метод, описанный с альтернативными способами для выполнения анализа CAFE, и выдвигают на первый план потенциальные ограничения.

Protocol

1. КАФЕ Пробирной Примечание: Анализ состоит из трех компонентов: экспериментальное флакон, специфическим крышкой и микро- капилляры. Пластиковая коробка с крышкой используется для транспортировки подготовленных ампул и более эффективно контролировать влажность. <l…

Representative Results

Мухи ж 1118 генотипа используются для демонстрации того, как выполняется анализ. Ш 1118 мутанты обычно используются для генерации трансгенных линий и контролировать генетический фон трансгенов , отмеченные белым геном. Как правило, для поведенч…

Discussion

В докладе описывается анализ CAFE в моде шаг за шагом, сосредоточив внимание на технической установке и его успешной работы в лаборатории. Благодаря своей простоте, этот анализ также может быть использован в качестве педагогически школьного эксперимента. Примеры показывают , что анализ …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the past and present members of the Scholz lab for discussion and Helga Döring for excellent technical support. We especially thank the members of the Biocenter workshop of the University of Cologne for their support and creativity. The work is supported by SFB 1340, SysMedAlc, and DAAD-Siemens.

Materials

Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x29 x18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer`s Yeast 299.33 g
Cornmeal 1200g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

References

  1. Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders – anorexia nervosa and bulimia nervosa – for German society. Eur. J. Health Econ. 3 (4), 244-250 (2002).
  2. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
  3. The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015)
  4. Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
  5. Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
  6. Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
  7. Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65 (2), 132-137 (2009).
  8. Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
  9. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
  10. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  11. Dethier, V. G. . The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , (1976).
  12. Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
  13. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  14. Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
  15. Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
  16. Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
  17. Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
  18. Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
  19. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), e101107 (2014).
  20. Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
  21. Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
  22. Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12 (7), 609-612 (2015).
  23. Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
  24. Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19 (24), 2126-2132 (2009).
  25. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (7), 2498-2503 (2008).
  26. Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36 (11), 1903-1912 (2012).
  27. Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20 (11), 1006-1011 (2010).
  28. Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (33), 14833-14838 (2010).
  29. Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
  30. Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9 (6), e99732 (2014).
check_url/kr/55024?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

View Video