Summary

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em> Drosophila melanogaster</em

Published: March 17, 2017
doi:

Summary

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Abstract

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

Introduction

Mangiare è essenziale; tuttavia, la deregolamentazione di assunzione di cibo con conseguente disturbi alimentari come la bulimia, l'anoressia o la tendenza generale a mangiare troppo impone costi sugli individui e sulla società 1, 2, 3. L'obiettivo della presente ricerca è quello di scoprire meccanismi di regolazione dell'assunzione di cibo e di fornire una strategia per eludere la formazione di disturbo. Numerosi studi che utilizzano organismi modello mammiferi hanno fornito nuove intuizioni del circuito e il ruolo dei sistemi di segnalamento in disturbi alimentari 4, 5, 6. Tuttavia, la nostra conoscenza delle basi neuronali e molecolari alla base di questi disturbi è lungi dall'essere completa. Negli ultimi anni, la mosca della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema modello valido per svelare intuizioni meccanicistici di base nella regolamentazione dei metabolism 7, 8, 9. Il test capillari alimentatore (CAFE) per Drosophila melanogaster è stato istituito nel laboratorio di Seymour Benzer nel 2007 ispirato da un precedente lavoro di Dethier in blowfly 10, 11. Il saggio CAFE ha permesso di misurare direttamente l'assunzione di cibo in Drosophila melanogaster. In questo sistema di test comportamentali, le mosche si nutrono di alimenti liquidi forniti nei capillari di vetro graduati posti all'interno di un flaconcino. Il declino del menisco capillare indica la perdita della soluzione di alimentare attraverso l'evaporazione e il consumo di cibo. La determinazione del tasso di evaporazione da fiale senza linea consente la quantificazione accurata di assunzione di cibo.

Il saggio Café è uno dei diversi paradigmi comportamentali utilizzati per misurare l'alimentazione in Drosophila melanogaster e ricercatori devono scegliere quello più appropriato per la loro specificadomanda. La decisione di utilizzare un certo dosaggio devono considerare i seguenti punti: la natura del cibo fornito; la condizione di alimentazione; la misura di assunzione o l'assorbimento delle sostanze nutritive e consumo di cibo indagini o risposta al cibo.

Il saggio CAFE, come descritto in questo rapporto è ideale per seguire l'assunzione di cibo di una fonte di cibo liquido sotto una condizione di alimentazione in posizione verticale. Alternativamente l'assunzione di cibo può essere misurata per un gruppo mosca su una fonte di cibo colorato in una fiala o su una placca. Le mosche sono normalmente uccisi o anestetizzati dopo l'alimentazione e la quantità di colorante ingerita è determinato per spettrofotometria o ispezione visiva dell'addome macchiato. Mosche iniziano a espellere cibo ingerito solo 30 minuti dopo l'assunzione, quindi questo approccio è difficile da usare per l'analisi di alimentazione più continuo comportamenti 12, 13.

In contrasto con le mosche sono mantenuti intatti quando colorante assorbibiles con traccianti radioattivi vengono utilizzati e il loro consumo di radioisotopi è segnato in un contatore a scintillazione 14, 15. L'assorbimento di radiomarcato da parte del sistema digestivo fly rende possibile la misurazione alimentare l'assorbimento a lungo termine, ma potrebbe portare a sottovalutare il consumo a causa di molecole non assorbita ed escreta tracciante. Un altro approccio per misurare la risposta al cibo in Drosophila melanogaster è la risposta proboscide estensione (PER), che normalmente si verifica per l'assunzione di cibo 16. Questo metodo elegante misura la prima risposta a uno stimolo cibo, ma non registra la quantità di assunzione. L'assunzione di cibo viene regolato in modo dinamico durante l'alimentazione utilizzando diversi segnali di feedback post-digestive che sono fondamentali per la regolazione di alimentazione 17, 18. Diversi tentativi sono stati fatti negli ultimi anni per la raccolta di dati semi-automatizzare nel saggio PER <sfino class = "xref"> 19, 20. Il PER viene rilevata da un pad elettrico o una combinazione di elettrodi e contato tramite computer. Combinando il saggio PER con radioisotopi assorbimento ha rivelato che questo test è limitata dalla bassa sensibilità per rilevare le differenze di alimentazione quantità 18. Il saggio alimentazione manuale (MAF) 21, in cui una mosca viene alimentato manualmente con un capillare di vetro, è stato recentemente sviluppato per misurare l'assorbimento alimentare in una singola mosca immobilizzato. Il saggio MAFE elimina le interferenze di foraggiamento e l'alimentazione iniziazione e ha una risoluzione temporale di secondi, e l'avvio di PER e il consumo di cibo può essere monitorata in modo indipendente nel saggio. Tuttavia, il modo in cui l'immobilizzazione della mosca colpisce alcuni aspetti del comportamento alimentare (ad es locomozione, la motivazione) deve ancora essere indagato. Per ottime recensioni comparative di diversi test per misurare il consumo di cibo in Drosophila melanogaster e per aiutare i ricercatori trovare quello più adatto, vedi relazioni Deshpande e Marx 13, 22.

Il saggio CAFE evita alcuni degli svantaggi di altri saggi descritti sopra e combina semplicità d'uso con misurazione affidabile di assunzione di cibo. Qui, una descrizione dettagliata del saggio CAFE è fornito e mostriamo una semplice modifica di configurazione per ridurre l'evaporazione. I risultati rappresentativi, tra cui un test di due alimenti scelta (a breve e lungo termine) e l'assorbimento di saccarosio di mosche è dimostrata. Nella discussione si confronta il nostro metodo descritto con modi alternativi per eseguire il test CAFE, ed evidenziare potenziali limitazioni.

Protocol

1. Il test CAFE NOTA: Il saggio è costituito da tre componenti: un flaconcino sperimentale, un coperchio specifico e capillari micro. Una scatola di plastica con coperchio viene utilizzato per trasportare i flaconi preparati e per controllare l'umidità in modo più efficiente. Utilizzare un Drosophila melanogaster fiala di cultura plastica (opzionale altezza 8 cm, 3,3 centimetri di diametro) come un tubo per il saggio. Sigillare la fiala con un coperchio i…

Representative Results

Le mosche del w 1118 genotipi sono utilizzati per dimostrare come viene eseguito il test. I w 1118 mutanti sono comunemente usati per generare le linee transgeniche e di controllare il background genetico di transgeni contrassegnato con il gene bianco. Normalmente, per esperimenti comportamentali, tutte le linee transgeniche sono reincrociata per cinque generazioni alla stessa w 1118 magazzino, che viene utilizzato come…

Discussion

La relazione descrive il saggio CAFE in modo passo-passo, concentrandosi sulla configurazione tecnica e le sue prestazioni di successo in laboratorio. Grazie alla sua semplicità, questo dosaggio potrebbe anche essere usato come educativo esperimento scuola. Gli esempi mostrano che il saggio permette di indagine di cibo rilevamento, privilegiate e di consumo in Drosophila melanogaster per periodi di tempo brevi e più lunghi (ore o giorni). Il saggio CAFE è stato utilizzato ampiamente nel campo di indagare tem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the past and present members of the Scholz lab for discussion and Helga Döring for excellent technical support. We especially thank the members of the Biocenter workshop of the University of Cologne for their support and creativity. The work is supported by SFB 1340, SysMedAlc, and DAAD-Siemens.

Materials

Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x29 x18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer`s Yeast 299.33 g
Cornmeal 1200g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

References

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Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

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