Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Clostridium difficile er en av de viktigste årsakene til sykehus antibiotika-assosiert diaré infeksjoner 1. Dette Gram-positive anaerob bakterie er overført gjennom sin spore form via fekal-oral rute. I det siste tiåret, ny '' epidemi '' eller '' hypervirulent '' stammer (f.eks BI / NAP1 / 027) forårsaket en drastisk økning i nye infeksjoner og dødsfall priser i Nord-Amerika og Europa to. C. difficile -associated sykdom (CDAD) er en livstruende tykktarmsbetennelse med høye dødsfall priser 3. Symptomene varierer fra diaré 4 til pseudomembranøs kolitt 5 og ofte dødelig toksisk megakolon 6.
Behandling av CDAD er vanskelig som de virulente stammer er multiresistent og tilbakefall er høy 7. I øyeblikket terapi omfatter antibiotika metronidazol, fidaxomicin eller vancomycin, eller i repetitisvis tilbakevendende tilfeller fekal microbiota transplantasjon. Nye terapeutiske strategier er sterkt behov 8. Noen fremgang er registrert som terapeutisk monoklonalt antistoff Bezlotoxumab, rettet mot C. difficile toksin B 9, har nylig bestått fase III kliniske studier, og ble innlevert for godkjenning hos FDA og EMA. I tillegg er nye antibiotika blir testet i øyeblikket på ulike stadier av kliniske studier 10.
Å utvikle effektive behandlingen nye terapeutiske mål må identifiseres. Den nylig oppdaget C. difficile protease prolin-prolin endopeptidase-en (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) er en slik lovende mål, som mangel på PPEP-en i en knock-out belastningen avtar virulens av C . difficile in vivo 11. PPEP-en er et utskilt metalloprotease 12,13 spalte to C. difficile adhesinene på deres C-terminale 13 dermed frigjøre tilhenger bakterielleia fra den menneskelige tarmen epitel. Derfor er det involvert i å opprettholde balansen mellom de fastsittende og bevegelige fenotype av C. difficile. Å utvikle selektive hemmere mot PPEP-en og for å forstå hvordan den gjenkjenner sine underlag intim kjennskap til sin tredimensjonale struktur er uunnværlig. Vi har løst den første krystallstrukturen av PPEP-1 alene og i kompleks med et substratpeptid 14. PPEP-1 er det første kjente protease som selektivt spalter peptidbindinger mellom to prolinrester 15. Det binder substratet i en dobbel knekk måte og stabiliserer den til en utvidet alifatisk-aromatisk nettverk av rester som befinner seg i S-sløyfe som dekker protease aktivt sete 14. Dette substrat-bindende modus er unik for PPEP-en og som ikke finnes i humane proteaser til dags dato. Dette gjør det til en lovende medikament mål, og off-target effekter av hemmere svært usannsynlige.
Å utvikle og skjerm selektiv PPEP-en inhibitors i fremtiden en stor mengde ren og monodisperse PPEP-1-proteinet er nødvendig. Videre, for å bestemme hvilken modus av binding av første inhibitorer, co-krystallstrukturer med PPEP-en er nødt til å bli bestemt. I våre hender PPEP-en produserer stadig vokst krystaller. Dermed har vi utviklet en optimalisering prosedyre for å produsere enkle diffraksjon kvalitet krystaller av PPEP-en. I denne protokollen beskriver vi i detalj produksjon, rensing, krystallisering og struktur løsning av PPEP-1 14. Vi bruker intracellulær ekspresjon i Escherichia coli av et PPEP-en variant som mangler sekresjon-signalsekvensen, affinitetskromatografi og størrelse-eksklusjonskromatografi med fjernelse av rensingen tag, etterfulgt av microseeding 16 inn i en optimaliserings skjerm og strukturbestemmelse via sink enkelt-bølgelengde anomal dispersjonen (sink-SAD) 17. Denne protokollen kan tilpasses for produksjon og strukturbestemmelse av andre proteiner (for eksempel </ Em> metalloproteaser) og spesielt for proteiner som produserer vokst krystaller. På forespørsel plasmid DNA av konstruksjonen (pET28a-NHis-rPPEP-1) og diffraksjon data kan være tilgjengelig for pedagogiske formål.
Røntgenkrystallografi er fortsatt den raskeste og mest nøyaktige metode for å bestemme tredimensjonale nær-atom oppløsning strukturer av proteiner 28. Det krever imidlertid veksten av velordnet enkle krystaller. Disse er ofte vanskelige å få, og den krystallinske tilstand er kunstig. Imidlertid er en sammenligning av proteinstrukturer bestemt ved røntgen-krystallografi med de som er bestemt av andre fremgangsmåter, spesielt NMR, viser generelt en meget god overensstemmelse. I tilfelle av PPEP-1, en N…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de ansatte på beamline X06DA på Swiss Light Source, Paul-Scherrer-instituttet, Villigen, Sveits for støtte under synkrotron datainnsamling. Vi er takknemlige for Monika Gompert for utmerket teknisk støtte. Prosjektet ble støttet av Universitetet i Köln og gi INST 216 / 682-1 FUGG fra den tyske Forskningsrådet. En doktorgrad fellesskap fra International Graduate School i utvikling helse og sykdom til CP angivelse. Den forskning som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra Det europeiske fellesskap syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskuddsavtalen No. 283570 (BioStruct-X).
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |