Il disegno sperimentale per Microdissezione laser RNA-Seq: Lezioni da una analisi dello sviluppo di mais Leaf

La foglia mais è un modello ideale per studiare la formazione di campi di sviluppo durante morfogenesi, in quanto ha un confine netto tra la lama e guaina che è suscettibile di dissezione genetica (Figura 1A). Durante le prime fasi di sviluppo foglia, una banda lineare di celle più piccole, la band preligule (PLB), suddivide il primordio foglia in domini pre-blade e pre-guaina. A ligule frange-like e atri triangolari sviluppano dalla PLB (Figura 1A, C, D). schermi genetici hanno identificato mutazioni che inficiano il confine lama-guaina. Ad esempio, liguleless1 recessivo (LG1) mutazioni eliminare la ligula e orecchiette ^{1, 2, 3, 4} (Figura 1B). L'ibridazione in situ ha rivelato che la trascrizione LG1 si accumula al PLB e ligula emergente, che lo rende un ottimo indicatore per lo sviluppo ligula ^{5, 6} (Figura 1E).

Figura 1: wild-type e foglie di mais liguleless1-R. (A) regione Blade-guaina confine del maturo wild-type foglio che mostra le strutture ligula e padiglione auricolare. (B) regione Blade-guaina confine del maturo liguleless1-R foglio che mostra l'assenza di strutture ligula e padiglione auricolare. Foglie in A e B sono stati tagliati a metà lungo la nervatura centrale. (C) Sezione longitudinale attraverso wild-type foglia primordio. Esempio è stato elaborato e colorati per l'analisi istologica. Il ligule avvio è evidente come un urto che sporge dal piano della foglia (freccia). (D) sez longitudinaleioni attraverso wild-type foglia primordio. Esempio è stato elaborato per LM come descritto nel testo. Arrowhead indica l'avvio ligula. (E) lg1 ibridazione in situ di ripresa apex sezione longitudinale laterale. Gli asterischi indicano l'accumulo di trascrizione LG1 al PLB del primordio foglia P6. Le frecce indicano base del P6 primordio. La barra indica misura dalla base del primordium al PLB. Barre di scala in A e B = 20 mm. Barre di scala nella CE = 100 micron. Questa cifra è stata modificata da riferimento ⁶ (Copyright dell'American Society of biologi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

In questo studio, LM RNA-Seq è stato impiegato per identificare una serie di geni che sono differenzialmente espressi (DE) alla lama fodero confine rispetto ad altre parti del primordium foglia e di ide i geni che sono ntify DE in LG1-R mutanti rispetto al wild-type fratelli. LM RNA-Seq è un metodo per quantificare l'accumulo di trascrizione in cellule specifiche o domini cellulari ^7. sistemi LM combinano un laser e un microscopio con una fotocamera digitale. tessuto sezionato è montato su guide e vista attraverso il microscopio. Il software LM in genere include strumenti di disegno che consentono all'utente di delineare qualsiasi regione selezionata per microdissezione. I tagli laser lungo la linea, e il tessuto selezionato viene catapultato dal vetrino e in un tubo sospeso sopra la diapositiva. LM consente all'utente di microdissect domini precise, comprese strati cellulari specifici e anche le cellule singole ^{8, 9.} RNA può quindi essere estratta dal tessuto microdissezione. Successivamente, il componente di RNA-Seq utilizza sequenziamento di prossima generazione per sequenziare librerie di cDNA generate dal estratto RNA ^10,= "xref"> 11.

I principali vantaggi di LM RNA-Seq sono la capacità di quantificare l'accumulo di trascrizione in domini ben definiti e la capacità di profilare l'intero trascrittoma contemporaneamente ^7. La tecnica è particolarmente adatto per sondare eventi precoci di sviluppo in cui la regione di interesse è spesso microscopica. Studi precedenti hanno utilizzato LM combinato con la tecnologia microarray per studiare i processi evolutivi nelle piante ^{9, 12, 13.} RNA-Seq ha il vantaggio di quantificare trascritti attraverso un'ampia gamma dinamica, compresi i geni espressi basso, e le informazioni prima sequenza non è necessaria ^{10, 11.} Inoltre, LM RNA-Seq ha il potenziale per evidenziare evolutivamente importanti geni che possono essere perse nelle schermate di mutagenesi a causa di ridondanza genetica, o per letalità della perdita-di-funzione di mutante.

Geni evolutivamente importanti, come sheath1 stretto (NS1) e a forma di coppa cotyledon2 (cuc2), hanno spesso specifici pattern di espressione di una sola o poche cellule ^{17, 18, 19, 20.} Molti sono espressi solo durante le prime fasi di sviluppo e non nell'organo maturo. Quando interi organi o grandi domini vengono analizzate, queste trascrizioni specifici delle cellule sono diluiti e non possono essere rilevati nelle analisi più convenzionali. Permettendo analisi di domini ben definiti, LM RNA-Seq permette a questi geni tessuto-specifici per essere identificati e quantificati.

fattori cruciali per il successo degli esperimenti descritti qui erano una approfondita analisi istologica che ha guidato la selezione della fase di sviluppo appropriato e dominio per l'analisi, e precisa MeasureMent dei domini delle cellule dei tessuti per LM. Per assicurare che i domini equivalenti sono stati campionati per tutte le repliche, il tessuto è stato raccolto dalla foglia primordi allo stesso stadio di sviluppo ei domini microdissezione stati misurati rispetto a punti di riferimento morfologici come la ligule emergente (Figura 2). E 'noto che alcuni geni sono espressi in un gradiente dalla punta alla base della foglia. Misurando domini precisi, variazione dovuta al campionamento da posizioni diverse lungo l'asse prossimale-distale foglia è stato ridotto al minimo (figura 3A). Con microdissecting domini della stessa dimensione, variazione dovuta differenziale diluizione dei trascritti specifici delle cellule è stato ridotto (Figura 3B). Laterali sezioni longitudinali dell'apice riprese stati usati per tutte microdissections. Questi sono sezioni che sono perpendicolari all'asse nervatura-margine (Figura 4). Usando solo le sezioni che includono il SAM assicura che le regioni laterali equivalenti diprimordi fogliari vengono analizzati.

In campioni trattati e sezionate per LM, il primo segno morfologico escrescenza ligule è un urto sul lato adaxial causa di divisioni cellulari periclinal nell'epidermide adaxial (Figura 1D, Figura 2). È stato stabilito che la ligula emergente potrebbe essere identificate in modo attendibile a plastochron 7 primordi fogliari fase. Eravamo interessati a geni espressi in tutta la regione, tra cui la ligula ligula emergenti e le cellule immediatamente distali che formeranno il padiglione auricolare. Al fine di garantire che le selezioni tessuto equivalenti sono state effettuate, il bump ligula è stato utilizzato come punto di riferimento morfologica e un rettangolo 100 micron centrata su urto ligule stato selezionato per LM (Figura 2A, 2B). rettangoli equivalenti dimensioni di pre-lama e pre-guaina sono stati selezionati dalle stesse primordi fogliari.

Le analisi delle piante mutanti liguleless presentato un Challe diversoESN; LG1-R mutanti non formano un ligule, quindi questa caratteristica morfologica non può essere utilizzato per selezionare la regione per LM. Invece, il dominio di accumulo trascrizione lg1 in wild-type leaf primordia stata determinata, ed una regione che comprenda questo dominio è stato definito. Queste analisi preliminari sono state effettuate su piantine dalla stessa piantagione come sono stati utilizzati per l'analisi finale, dal lavoro precedente ha mostrato che la posizione del PLB varia a seconda delle condizioni di crescita. L'ibridazione in situ ha indicato che le trascrizioni LG1 si accumulano nel PLB di P6 foglia primordi (Figura 1E). Abbiamo scelto un dominio 400-900 micron dalla base della primordia foglia che comprendeva il dominio di espressione lg1 (rettangoli viola, Figura 2A) e catturato queste regioni equivalenti da wild-type e piante lg1-R. Per ridurre al minimo la variazione in background e di crescita genetiche condizioni quando si confrontano transcript accumulo in LG1-R e le piante wild-type, segreganti famiglie di mutanti e wild-type fratelli sono stati utilizzati.