がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、
Summary
Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.
Abstract
Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.
Introduction
X線結晶構造解析はされている、および、リガンド – 受容体相互作用の性質を理解するための非常に強力な技術であり続けるだろう。アトミック詳細にこれらの相互作用を可視化することにより、多くの生物学的プロセスを支配する分子メカニズムを漏らすすることが可能であるが、直接治療的利益のための接触界面を変更することも可能であるのみならず。このような表面プラズモン共鳴および等温滴定熱量測定（名ほんの）のような技術を用いて結合され、そのような修飾は、次いで、結合親和性は、相互作用の動力学、及び熱力学に直接影響を評価するための生物物理学的に分析することができます。最後に、関連する細胞型上の官能実験を行うことにより、受容体 – リガンド相互作用の修飾の分子と機能的影響の詳細画像は、非常に具体的なメカニズムの情報を提供し、収集することができます。全体として、これらの方法のこれらのタイプは、抑止を可能にする原子分解能画像を提供します診断および治療の進歩のために付随する意味合いで、どのように動作するか、生物学的システムのmination。
私たちの研究室では、日常的に自己免疫における、および移植の際に、病原体および癌に対するヒトT細胞免疫を仲介する受容体を研究するためにこれらの技術を使用しています。ここでは、T細胞受容体（TCR）とヒト白血球抗原（HLA）拘束性腫瘍由来ペプチド（pHLA）との間の相互作用により媒介される癌に対するヒトCD8 + T細胞応答、に焦点を当てます。 CD8 + T細胞が、癌細胞を標的とすることができるが、我々などが以前の抗癌性TCRが最適にそれらの同族pHLA 1,2に結合することが示されている、ので、これは重要です。したがって、多くの研究室は、TCR 3、4、5またはペプチドリガンド6のいずれかを変更しようとしています免疫原性を増加させるために、より良い標的癌細胞へのクラス= "外部参照"> 7、8。しかしながら、これらのアプローチは、必ずしも有効ではなく、オフターゲット毒性4、9、10を含む重篤な副作用を有することができます。癌抗原のT細胞認識を支配する分子メカニズムを探求さらなる研究は、これらの欠点を克服するために不可欠となります。
本研究では、我々は、最も一般的に* 0201（HLA-Aによって提示された100（gp100の）の糖タンパク質分化メラニン細胞抗原のフラグメントに対して特異的なCD8 + T細胞による自家メラノーマ細胞に対する応答、gp100の280-288、に焦点を当て-expressed人間pHLAクラスI）。この抗原は、メラノーマの免疫療法のために広く研究対象となっているとバリンがアラニンに置き換えられている、いわゆる「ヘテロクリティック」ペプチドとして開発されていますアンカー位置9でpHLA安定性11を向上させることができます。このアプローチは、 インビトロで黒色腫反応性CTLの誘導を増強するために使用され、成功した臨床試験12に使用されています。しかし、ペプチド残基の改変は、臨床6、13で最もheteroliticペプチドの乏しい有効性によって実証T細胞特異性の予測できない効果を有することができます。実際に、ペプチド残基Glu3をAlaに置換されたgp100の280-288の別のヘテロ形態は、gp100の280-288特異的T細胞14,15のポリクローナル集団による認識を廃止しました。我々は以前、ペプチドアンカー残基であっても軽微な変更は、実質的に予測不可能な方法6、16においてT細胞認識を変えることができることを実証しました。したがって、この研究は、構築に焦点を当てCD8 + T細胞がgp100のを認識し、どのようなTCRとpHLAとの間の相互作用の修飾は、この機能に影響を与えることができる方法のより詳細な画像をる。
ここでは、HLA-A * 0201（A2-YLE）によって提示されたgp100 280-288のための特異的な2つのTCRの高純度、可溶性形態、ならびにpHLAの自然と変更されたフォームを生成しました。これらの試薬は、ヘテロA2-YLEの形態、ならびに非連結形態における突然変異pHLAs二との複合体中のヒトTCRの三原子構造を解決するためにタンパク質結晶を生成するために使用しました。我々は、その後に深い生物物理学的実験を行うことでのTCRのペプチドの置換の影響を実証するペプチドスキャン法を用いました。最後に、我々は、様々なペプチドの修飾の生物学的影響を試験するために、機能の実験を行うために、A2-YLE特異的TCRのいずれかを発現するように再プログラムされた、遺伝的に改変されたCD8 + T細胞株を生成しました。これらのデータは、さらにモディことを実証していますficationsは予測できないノックオンTCR結合およびT細胞認識無効に隣接するペプチド残基に影響を与えることができ、TCR結合モチーフの外側にある残基をペプチドに。我々の調査結果は、黒色腫のためのこの重要な治療標的のT細胞認識の基礎となる構造的機構の第1の例を表します。
Protocol
1.タンパク質発現先に詳細に記載されるように、 図17に示すように 、可溶性のTCRとpHLAsの生成のための遺伝子構築物を作る18。 5 'BamH1および3' pGMT7ベクターへの挿入のためのEcoR1制限部位で構成する各設計。 4℃で5分間、 大腸菌の5μLと50-200 ngの/μLのプラスミドの1μLをインキュベートすることにより、目的のタンパク質をコードする配列を含むpGMT7由来のプラスミドベクターで大腸菌ロゼッタ（DE3）pLysS株を変換、42°Cで2分間、そして4℃で5分間、および50 mg / Lのカルベニシリンを補充したLB寒天プレート上で37℃で一晩プレート。 個々のコロニーを選択し、37℃、TYPメディア（16グラム/ Lトリプトン、16グラム/ Lの酵母抽出物、および5グラム/ L HK 2 O 4）の30ミリリットルで220 rpmで成長するサスペンションまで、100μMのカルベニシリンを補充しました光学ドに達しますnsity 0.4〜0.6の（OD 600）。 3時間、0.5mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を導入することにより、5mLのアリコート中のタンパク質の産生を誘導します。し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析のための誘導なしの懸濁液20μLを維持し、ゲルを染色。 100μMのカルベニシリンを補充したTYP 1Lにスターター培養物を添加し、懸濁液を0.4と0.6の間のOD 600に達するまでステップ1.3で説明したように細胞を増殖させます。 0.5mMのIPTGで3時間、タンパク質の発現を誘導します。 3000×gで20分間、細胞を遠心分離し、上清を注意深く捨てます。 2秒間隔を使用して、60％のパワーで30分間、氷上で超音波処理溶解緩衝液の40ミリリットル（10％グリセロール、10mM塩化マグネシウム、 塩化マグネシウム; 150mMのNaCl、10mMのトリス、pHが8.1）でペレットを溶解0.1g / L DNaseで30分間、室温（RT）でインキュベートします。 SUSトリート洗浄緩衝液の100mLの（、50 mMトリス、pHを8.1; 100mMのNaCl、および10mM EDTA、0.5％トリトンX-100）を用いて封入体（IB）の形でタンパク質を含む年金。 4℃で20分間および8000×gでのサンプルを遠心分離し、上清を注意深く捨てます。再懸濁再懸濁バッファー（50 mMトリス、pHが8.1; 100mMのNaCl;および10mM EDTA、pHは8.1）100mL中のペレット、8,000×gで以前のように遠心分離をし、慎重に上清を捨てます。 最後に、グアニジン緩衝液10mlにペレットを溶解し（6Mのグアニジン、50mMのトリス、pHが8.1、2mMのEDTA、pHは8.1、および100mMのNaCl）と分光光度計を用いて280nmでのタンパク質濃度を測定します。 2. pHLAとTCRのリフォールディング pHLAのリフォールドは、（ビオチンタグまたはHLA-A2）、HLA-A2の30 mgの混合のIB、β2MIBSの30mgを、最終体積水浴中で37℃で30分間、ペプチドの4ミリグラム10mMのジチオスレイトールを補っグアニジンバッファーの6ミリリットルの（DTT）。 あらかじめ冷却HLAのリフォールディング緩衝液1Lに、前のミックスを希釈することにより、タンパク質のリフォールディングを開始します（50 mMトリス、pHが8.1; 400mMのL-アルギニン、2mMのEDTA、pHが8.1; 6ミリモルのシステアミン;および4mMのシスタミン）。 HLAを3時間4℃で攪拌リフォールディングした後、12.4 kDaのMWCO（分子量カットオフ）透析チューブにそれを移し、10 mMトリス、pHが8.1の20 Lに対して24時間透析回残します。 TCRをリフォールドするために、10mMのDTTで補充グアニジン緩衝液6 mLの水浴中で37℃で30分間TCRα鎖IBSの30 mgのとTCRβ鎖IBSの30 mgの混合。 あらかじめ冷却TCRのリフォールディング緩衝液1Lに変性したTCRの混合物を希釈することにより、タンパク質のリフォールディングを開始します（50 mMトリス、pHが8.1; 2.5 M尿素; 2mMのEDTA、pHが8.1; 6ミリモルのシステアミン;および4mMのシスタミン）3のために時間。 12.4-kDaのMWCO透析チューブにリフォールディングを移し、10 mMトリス、pHが8.1の20 Lに対して24時間、二回透析。 pHLAまたはTCR refの両方をフィルタリング精製工程のために0.45μmのメンブレンフィルターを用い歳。 高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）3.精製柔軟かつ直感的なクロマトグラフィーシステム上の10 mMトリス、pHが8.1の20mLで予め平衡化し、7.9 mLの上に50μmの陰イオン交換樹脂カラムをフィルタリング再折り畳み準備（pHLAまたはTCRのいずれか）をロードします。 （8カラム体積にわたって、10 mMトリス中の0〜500mMのNaCl、pHは8.1）塩勾配で5ミリリットル/分でタンパク質を溶出し、1-mL画分を収集します。 、SDS-PAGEにより、目的のタンパク質に対応する画分を分析して一緒に目的のタンパク質を含む画分をプールし、4,000×gで20分間の遠心分離によって10-kDaのMWCO 20または10kDaのMWCO 4で500μLにそれらを集中フロースルーを廃棄します。 アプリで予め平衡化した24 mLのサイズ排除クロマトグラフィーカラムに2mLの注入ループに濃縮タンパク質製剤をロードropriate溶出緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、HBS（10mMのHEPES、pH7.4中、150mMのNaCl、3.4 mMのEDTA、0.005％界面活性剤）、または結晶バッファー（10 mMトリス、pHが8.1、および10mMのNaCl ）。 0.5mL /分の体積のカラム1オーバーの流量でタンパク質を溶出させます。 SDS-PAGEにより確認対象のタンパク質を含有する1mLの画分を収集します。 YLEPGPVTA（A2-YLE）、YLEPGPVTV（A2-YLE-9V）、ALEPGPVTAとHLA-A * 0201：注：これらのメソッドは、可溶性PMEL17 TCRとのgp100のTCRを生成するために使用されただけでなく、本研究で用いたpHLAsのすべて（A2-YLE-1A）、YLAPGPVTA（A2-YLE-3A）、YLEAGPVTA（A2-YLE-4A）、YLEPAPVTA（A2-YLE-5A）、YLEPGAVTA（A2-YLE-6A）、YLEPGPATA（A2-YLE-図7（a））、またはYLEPGPVAA（A2-YLE-8A）。 4.表面プラズモン共鳴（SPR）分析 CM5センサーチップ19を搭載した分子間相互作用解析システムを用いて平衡結合分析または熱力学解析を実行します。 fでCM5チップを活性化させます牛の鳴き声1：10μL/分の流速で、25℃で10分間、100mMのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および400mMの1-エチル-3-（3-ジメチルプロピル）-carboiimide（EDC）の1ミックスC. すべての4つのフローセルにチップ表面に結合する共有することにより（10mMの酢酸、pH4.5中では200μg/ mLでの110μL）ストレプトアビジンの負荷約5000応答単位（RU）と非アクティブに1 M塩酸エタノールアミンの100μLを使用残りの反応基。 （製造業者によって提供される）商業バッファ中〜1μMでpHLAのカップル約500-600 RU、10μL/分の遅い流量でCM5センサーチップにチップ表面に均一な分布を確実にします。 60秒間（メーカーによって提供される）商業バッファ内の1 mMのビオチンとチップ表面を飽和。 25℃で30μL/ minの高流速で、関連するフローセルの上に可溶性TCRの10連続希釈液を注入します。 平衡結合定数を計算します（K D（E））は、非線形曲線フィット（Y =（P1xと）/（P2 + x））の20を使用して値を。 注：Y =応答単位で、x =アナ濃度、P1 = R 最大 、P2 = K D。 1と仮定動態分析の実行：結合1ラングミュアおよびソフトウェアパッケージ2内のグローバル適合アルゴリズムを使用してデータをフィット。 5°C、12°C、18°C、25°C、30°C 19：以下の温度では、この方法を繰り返すことにより、熱力学実験を行います。 標準的な熱力学の式（ΔG°= -RTlnK D）19を使用して°ΔGを計算するために、異なる温度でSPRによって決定K D値を使用します。 注：R =気体定数、T Kで=温度、LN =自然対数。 19 -ギブス・ヘルムホルツ方程式（TΔS°ΔG°=ΔH）に応じて熱力学的パラメータを計算します。 </李> 3パラメータ方程式（Y =ΔH+ΔCP*（X-298）-x *に適合するように、非線形回帰を使用して、温度（K）に対して、結合自由エネルギー、ΔG°（ΔG°= -RTlnK D）をプロットΔS- X *ΔCP* LN（X / 298））19。 注：X =ΔG°、K中のy =温度。 5.等温滴定熱量測定（ITC） 等温滴定熱量計を用いてITC実験を行います。熱量計セルに30μMpHLAを注入し、シリンジ内に210μMの可溶性TCRをロードします。以下の緩衝液条件を使用する：150mMのNaClを含む20mMのHepes（pH7.4）で。 20 TCR注射、2μLボリュームのそれぞれを実行します。解析用ソフトウェアを用いて、ΔHおよびK Dを計算します。 6.結晶化、回折データの収集、およびモデル洗練結晶化ロボットを使用して、結晶化試験を行います。 VAPにより結晶を成長させますまたは結晶化緩衝液（母液）21の60μLを含むリザーバと、96ウェルプレート中のシッティングドロップ技術を経由して18℃で拡散。 10-kDaの分子量カットオフ遠心濃縮で3000×gで回転させることにより結晶バッファでおよそ10mg / mLの（0.2ミリモル）に可溶性pHLAを集中。 およそ10mg / mLの（0.1ミリモル）でタンパク質溶液を得るために：1のモル比共複合体構造については、1でTCRとpHLAを混ぜます。 結晶化ロボットを用いた結晶化画面から各リザーバー溶液の200 nLのに、TCRとpHLA 1のモル比の混合物および24時間後に顕微鏡下で結晶に得点、48時間、72：200、単独pHLAのnLの、または1を追加します。時間、およびその後週に一度。 手動で顕微鏡下でクライオループでそれらを取り付け、液体窒素（100 K）でそれらを浸漬し、保存することによって、それらをクライオ冷却のHarvest単結晶。 注：ロード結晶がPRACのビットを取りますTICE、およびデータ収集のために十分である結晶決定は経験が付属しています。経験則として、結晶より大きく、より定期的に、より良いです。 100 Kでの窒素ガスのストリーム内のデータを収集します注：このデータは、ダイヤモンドライトソース（DLS）、英国の国家シンクロトロン科学施設で取得しました。 MOSFLM 22とXDSパッケージ23の両方を使用してxia2で反射強度を推定することによって、データを分析し、その後、SCALAや漫然24とCCP4パッケージ25との間でデータをスケーリング。 PHASER 26を用いて分子置換を有する構造を解決します。 COOT 27でモデルを調整し、REFMAC5 28でモデルを改良。 PYMOL 29でグラフィカルな表現を準備します。 「接点」を使用して連絡先を計算しますCCP4パッケージ内のプログラム。ファンデルワールス接触のための4Åカットオフと水素結合と塩橋3.4Åカットオフを使用してください。 CCP4パッケージに「SC」のプログラムを用いて表面の相補性を計算します。 30に記載されているように 、TCR-pHLA複合体の交差角度を計算します。 注：この研究のために、反射データと最終モデル座標は、PDBデータベースに寄託した（PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB：5EU6、A2-YLE PDB：5EU3、A2-YLE-3A PDB：5EU4、およびA2 -YLE-5AのPDB：5EU5）。
Representative Results
上記の方法を用いて、我々は、CD8 + T細胞によるイン深さのgp100 280-288認識の分子解析を行うために、可溶性TCR（ 表1）及びpHLA分子を生成しました。修正された大腸菌発現系は、それぞれ別個のTCR（α及びβ鎖）両方の鎖とpHLAs（α鎖及びβ2M）のための不溶性のIBを生成するために使用されました。この方法は、比較的安価で、セットアップが容易であるという利点を有しており、タンパク質（文化の100から500 mg / Lで）の大きな収量を生成します。 -80℃で保存した場合にも、不溶性のタンパク質は非常に安定です。私たちは、その後、機能、均質な、可溶性タンパク質を生成するために、十分に確立されたリフォールディングおよび精製技術を使用していました。この方法は、生物物理学的構造、および細胞実験のためのタンパク質、ならびに診断または治療のために使用することができる試薬を生成するために有用です。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= "1">ここでは、ペプチド骨格を横切っアラニン走査突然変異誘発実験を行うためにこれらのタンパク質を用いて、表面プラズモン共鳴（SPR）実験（ 表2）を用いてTCR結合親和性を評価しました。ペプチド中の残基を実証し、このアッセイは、TCR結合のために最も重要でした。高解像度は、タンパク質 – タンパク質相互作用を制御する生物学的メカニズムを決定するために極めて有用であるだけでなく、治療分子の結合親和性を分析するためのこの技術を使用して結合親和性の分析します。 私たちはその後、原子分解能（ 図1および図 2、 表3）で結合様式を調査するために改変された腫瘍由来pHLA（A2-YLE-9V）との複合体に黒色腫特異的可溶性TCR（PMEL17 TCR）を結晶化しました。これらの実験は、2つの分子間の結合界面の直接可視化を提供し、providin相互作用を支配する基本原理についてグラムのキー情報。我々はさらに（ 図3）に結合する有効精力的な貢献を明らかにし、SPRとITCの両方を使用して、相互作用の熱力学的解析を行いました。これらの分析はさらに、2つのタンパク質（ 図4および表4）との間の接触フットプリントの高解像度の説明によって支持されました。 私たちは、その後、特定の変異が（ 図5）TCR結合を廃止する理由分子スイッチが説明できることを明らかにし、ペプチドの変異型を提示し、ライゲーションされていないpHLA分子の構造を解決しました。 全体として、これらの技術は、T細胞が抗癌治療のための重要な標的である黒色腫由来の抗原を認識する方法を説明するメカニズムを示す新規のデータを提供しました。より広義には、これらの技術新規な治療の進歩のために標的とされる可能性があり、新たな生物学的メカニズムを明らかに、実質的に任意の受容体 – リガンド相互作用を研究するために使用することができます。 図1：密度プロット分析。左の列のショーは、モデルがペプチドの不存在下で洗練されたマップを省略します。差分密度は3.0シグマで輪郭され、正の輪郭は緑色で示され、負の輪郭が赤で表示されています。右側の列はREFMAC5によって適用される自動非結晶学的対称性の制約を使用して、その後の精密化後に1.0シグマ（タンパク質鎖のスティック表現の周りに灰色のメッシュとして示される）で観測されたマップを示しています。 （A）TCR CDR3とPMEL17 TCR-A2-YLE-9Vのためのモデルは、着色青（α鎖）とオレンジ（β鎖）と緑の中のペプチドをループします。 （B）とA2-YLEのためのモデルペプチドは暗緑色に着色します。 （C）ペプチドオレンジ色（A2-YLE-3Aのために、非対称単位中の2分子が存在したが、これらは省略して、密度マップの面で事実上同一であったので、1つだけをコピーするとA2-YLE-3Aのためのモデル）ここに示されています。 （D）ペプチド色のピンクとA2-YLE-5Aのためのモデル。参照31からの許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2：A2-YLE-9Vとの複合体中のPMEL17 TCRの概要。 （A）PMEL17 TCR-A2-YLE-9V錯体の漫画表現。 TCRは、黒色に着色されています。ダークグリーン、CDR2α;青、CDR3α;黄色、CDR1β、アクア、CDR2 ^ TCR CDRループは（赤、CDR1α示されています6 ;;オレンジ、CDR3β）。およびHLA-A * 0201を灰色で示されています。 YLE-9Vのペプチドは、緑色の棒で表されています。 （B）表面と（グレーA2、; YLE-9V、グリーンスティック）A2-YLEの表面に接触PMEL17 TCR CDRの残基の表現ループを（Aのように色分けされた）スティック。黒い対角線はYLEPGPVTVペプチド（46.15°）の長軸に対するTCRの交差角を示します。 （C）A2-YLE-9V表面上PMEL17 TCR（A2、灰色）の接触フットプリント。紫と緑（表面とスティックが）のgp100のTCRが接触し、それぞれ、HLA-A * 0201とYLE残基を示しています。水素結合とファンデルワールス接触のために4オングストロームのために3.4オングストロームのオフをカット。リファレンス31からの許可を得て転載。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alトン= "図3" src = "/ファイル/ ftp_upload / 54991 / 54991fig3.jpg" /> 図3：PMEL17 TCR-A2-YLEの相互作用の熱力学解析。 9〜10個のTCRの段階希釈を横切る（A）PMEL17 TCR平衡結合5でA2-YLEへの応答、12、18、25、および37°C。各曲線の挿入図に示されており、グローバルフィッティングアルゴリズム（BIA評価3.1）を使用し、K オフ値に Kを計算するために使用した：SPR生とフィットデータ（ラングミュア結合1を仮定する）。表には、各温度での平衡結合（K D（E））と運動結合定数（K D（K）= K オフ / K 上）を示しています。平衡結合定数（K D、μM）値は、非線形適合（Y =（P1xと）/（P2の+ xを））を用いて計算しました。 （B）熱力学的パラメータはギブズ-ヘルムホルツの式に従って計算した（ΔG°=ΔH° – TΔS°）。結合自由エネルギー、ΔG°（ΔG°= -RTlnK D）は 、温度に対してプロットした（K）3パラメータ方程式に適合するように、非線形回帰を使用して、（Y =ΔH°+ΔCP°*（X-298）-x *ΔS°-x *ΔCP° * LN（X / 298））。 298 K（25℃）でのエンタルピー（ΔH°）とエントロピー（TΔS°）キロカロリー/モルで示されており、温度（K）の非線形回帰により計算した自由エネルギーに対してプロットした（ΔG°）。 PMEL17 TCR-A2-YLEの相互作用のために（C）等温熱量測定滴定（ITC）測定。 298 K（25℃）でのエンタルピー（ΔH°）とエントロピー（TΔS°）はキロカロリー/モルに示されています。参照31からの許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <strオング>図4：PMEL17 CDRループは、ペプチドの残基PRO4、Val7、およびThr8に焦点を当てています。 （A）YLE-9VペプチドおよびPMEL17 CDRループ残基間の接触の概略図（図2（a）のように色分けされました）。パネルの下部にある数字は、TCRとペプチドとの間の合計の連絡先を示しています。 PMEL17 TCRとYLE-9Vのペプチドとの間の（B）コンタクトファンデルワールス接触（黒破線）と水素結合を示す（緑棒）（赤点線）TCRCDR3α（青）によって作られた、CDR1β（黄色） 、CDR2β（アクア）、およびCDR3β（オレンジ）ループ。下のパネルではYLE PRO4、Val7、およびThr8、それぞれ、およびTCR CDRループ残基（図1Aのように色分けスティック）間の接触の密接な図です。水素結合とファンデルワールス接触のために4オングストロームのために3.4オングストロームのオフをカット。参照31からの許可を得て転載。rge.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図5：HLA-A * 0201によって提示さYLE、YLE-3Aのコンフォメーションの比較、およびA2-YLE-5Aペプチド。 （A）YLE（ダークグリーンスティック）とYLE-3A（オレンジスティック）HLA-A * 0201α1ヘリックス（グレー漫画）の重ね合わせによるペプチドアラインメント。箱入り残基がアラニンにGlu3の変異を示しています。インセットはGlu3Ala置換はA2-YLEの構造と比較して、A2-YLE-3A構造における隣接残基PRO4の位置のずれ（黒い矢印）を引き起こす方法を示しています。 （B）YLE（ダークグリーンスティック）とYLE-5A（ピンクスティック）HLA-A * 0201α1ヘリックス（グレー漫画）の重ね合わせによるペプチドアラインメント。箱入り残基がアラニンへのグリシン5の変異を示しています。基準からの許可を得て転載<sup> 31。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 TCR CDR1α CDR2α CDR3α CDR1β CDR1β CDR1β PMEL17 DSAIYN IQSSQRE CAVLSSGGSNYKLTFG SGHTA FQGTGA CASSFIGGTDTQYFG gp100の TSINN IRSNERE CATDGDTPLVFG LNHDA SQIVND CASSIGGPYEQYFG <strオング> MPD KALYS LLKGGEQ CGTETNTGNQFYFG SGHDY FNNNVP CASSLGRYNEQFFG 296 DSASNY IRSNVGE CAASTSGGTSYGKLTFG MNHEY SMNVEV CASSLGSSYEQYFG 表1：TCR CDR3 PMEL17の地域、gp100の、MPD、および296のgp100特異的なTCRの整列。参照31からの許可を得て転載。 ペプチド配列 ペプチド PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3親和性K D gp100 TCR TRAV17 TRBV19アフィ無限大のK D YLEPGPVTA YLE 7.6±2μM 26.5±2.3μM YLEPGPVT V YLE-9V 6.3±1.2μM 21.9±2.4μM LEPGPVTA YLE-1A 15.9±4.1μM 60.6±5.4μM YL A PGPVTA YLE-3A いいえ結合しませんいいえ結合しません YLE A GPVTA YLE-4A 19.7±1.3μM 144.1±7.8μM YLEP A PVTA YLE-5A > 1 mMの > 1mMの YLEPG A VTA YLE-6A 11.4±2.7μM 954.9±97.8μM </tR> YLEPGP A TA YLE-7A 31.1±4μM 102.0±9.2μM YLEPGPV A A YLE-8A 38.1±7.4μM 121.0±7.5μM 表2：280-288 ペプチド変異体をGP100するPMEL17 TCRとのgp100 TCRの親和性分析（K D）。参照31からの許可を得て転載。 パラメーター PMEL17 TCR-A2-YLE-9V A2-YLE A2-YLE-3A A2-YLE-5A PDBコード</強いです> 5EU6 5EU3 5EU4 5EU5 データセットの統計情報 空間群 P1 P1 21 1 P1 P1 21 1 単位格子パラメータ（Å） = 45.52、B = 54.41、C = 112.12、= 85.0°、B = 81.6°、グラム= 72.6° = 52.81、B = 80.37、C = 56.06、B = 112.8° = 56.08、B = 57.63、C = 79.93、= 90.0°、B = 89.8°、グラム= 63.8° = 56.33、B = 79.64、C = 57.74、B = 116.2° 放射線源 DIAMOND I03 DIAMOND I03 DIAMOND I02 DIAMOND I02 波長（Å） 0.9763 0.9999 0.9763 0.9763 Measu赤の解像度の範囲（Å） 2.02から51.87 1.97から45.25 2.12から43.39 1.54から43.42 外側の解像度シェル（Å） 2.07から2.02 2.02から1.97 2.18から2.12 1.58から154 反射が観察されました 128191（8955） 99442（7056） 99386（7463） 244577（17745） ユニークな反射 64983（4785） 30103（2249） 49667（3636） 67308（4962） 完全性（％） 97.7（96.7） 98.5（99.3） 97.4（96.7） 99.6（99.9） 多重度 2.0（1.9） 3.3（3.1） 2.0（2.1） 3.6（3.6） I /シグマ（I） 5.5（1.9） 7.2（1.9） 6.7（20.3） 13（2.3） RPIM（％） 5.7（39.8） 8.8（44.7） 8.7（41.6） 4.5（35.4） R マージ （％） 7.8（39.6） 9.8（50.2） 8.7（41.6） 5.0（53.2） 洗練統計 解像度（Å） 2.02 1.97 2.12 1.54 無反射使用しません 61688 28557 47153 63875 Rfreeセットに反射しません 3294 1526 2514 3406 Rのcryst（なしカットオフ）（％） 18.1 19.7 17.2 17.0 R 無料 22.2 25.5 210.1 20.1 ルートは理想的な幾何学からの二乗平均偏差 結合長さ（Å） 0.018（0.019）* 0.019（0.019）* 0.021（0.019）* 0.018（0.019）* 結合角（°） 1.964（1.939）* 1.961（1.926）* 2.067（1.927）* 1.914（1.936）* 総合的なエラー（Å）を座標 0.122 0.153 0.147 0.055 ラマチャンドラン統計ほとんどの待遇 791（96％） 371（98％） 749（99％） 384（98％） 許可されました 32（4％） 6（2％） 10（1％） 5（1％） 外れ値 2（0％） 3（1％） 1（0％） 2（0％） 表3： データ削減および精密化統計（分子置換）。参照31からの許可を得て転載。括弧内の値は、最高解像度シェルのためのものです。 HLA /ペプチド残基 TCR残基 第VDW（≤4Å） 番号H-結合（≤3.4Å） Gly62 αGly98 3 αSer99 1 Arg65 αSer99 2 <td> Arg65 O αAsn100Nδ2 2 1 Arg65 NH1 βAsp58Oδ2 1 βSer59 8 Lys66 αGly98 1 αSer99 4 αAsn100 4 Ala69 αAsn100 2 βAla56 2 Gln72Nε2 βGln51O 3 1 βGly54 7 βAla55 1 <td> Thr73 βGln51 1 Val76 βGln51 3 βGly52 2 Lys146 βPhe97 3 βIle98 3 Ala150 βIle98 1 βAsp102 3 Val152 βIle98 1 Glu154 αTyr32 1 Gln155 N αTyr32OH 4 1 Gln155Oε1 βThr101N 10 1 <tr> TYR1 OH αGly97O 1 1 αGly98 1 αSer96 1 Glu3 αTyr101 1 PRO4 αSer96 1 αSer99 1 αAsn100 4 PRO4 O αTyr101N 14 1 Gly5 αTyr101 3 βGly100 2 Val7 βIle98 7 βGly99 2 βGly100 2 Thr8 βThr31 5 βGln51 1 βPhe97 1 Thr8 N βIle98O 6 1 表4：PMEL17 TCR-A2-YLE-9V連絡表。参照31からの許可を得て転載。
Discussion
ここで説明するプロトコルは、任意のヒトの疾患との関連におけるT細胞応答の分子や細胞解剖のためのフレームワークを提供します。癌は、本研究の主な焦点であったが、我々は、32、33、34、35、36、37及び自己免疫38、39、40の間のウイルスに対するT細胞応答を調査するために非常に似たアプローチを使用しています。さらに、我々は、T細胞抗原認識2、19、41、42を支配する分子の原理を理解するために、より広く、これらの技術を使用しています。実際、変更の予測不可能な性質は、残基をペプチドに、偶数のものTCR接触残基の外側に影響T細胞認識は、ヘテロクリティックペプチドの設計のために重要な意味を持ちます。これらの知見は、直接拡張診断45、46、47のと同様に、ペプチドワクチン6、43、および人工的な高親和性のTCR 3、4、5、20、44を含む、新規のT細胞療法の開発に貢献してきました。
プロトコル内の重要なステップ
高純度、機能性タンパク質の生成は、本論文で概説した方法の全てのために不可欠です。
修正およびトラブルシューティング
高純度のタンパク質を生成することの困難は、しばしば高度の発現に関連します-pure、 大腸菌発現系からの不溶性のIB。通常、表現プロトコル（ 例えば、異なる大腸菌株を使用して、異なる光学密度で誘導し、または異なるメディアの形成を使用して）変更すると、これらの問題を解決します。
技術の制限事項
これらの技術は、通常は細胞表面で発現される可溶性タンパク質分子（TCRとpHLA）を使用します。したがって、構造的/生物物理学的所見は生物学的意義を確認するために、携帯のアプローチと一致していることを確認することが重要です。
既存の/代替の方法に対する技術の意義
X線結晶構造解析および機能解析によって実証生物物理学の使用を介して、我々および他癌エピトープのためのTCRの特定は、一般的に低い結合親和48によって特徴付けられることを実証しました。この低TCRの親和性は、T細胞がアーカンソー理由を説明するのに役立つことがあり電子癌をクリアで自然に効果的ではありません。抗がんのTCRと同族腫瘍抗原の間の複合体の高分解能原子構造は、この弱い親和性の分子基盤を明らかにするために始めています。さらに、これらの研究は、将来の改善16を播種し、この問題を克服するために設計された治療的介入の根底にあるメカニズムを決定するために役立ちます。本研究では、gp100ののHLA-A * 0201拘束性メラノーマエピトープとの複合体、天然に存在するαβTCRの第1の構造を調べました。綿密な生物物理学的検査と組み合わせた構造は、相互作用の全体的な結合様式を明らかにしました。我々はまた、（表面プラズモン共鳴を用いて評価）結合TCRを抑止し、CD8 + T細胞認識（官能試験）ペプチドの変異形態で発生し、予期しない分子スイッチを発見しました。 HLA抗原presentatiのこの新しいメカニズムを実証するためにのみ可能でした説明した高解像度の方法を使用して上。
この技術を習得した後、将来のアプリケーションや方向性
堅牢な機能分析と組み合わせたときに全体的に、我々の結果は、X線結晶学および生物物理学的方法の力を発揮します。これらのアプローチを使用して、T細胞抗原認識を支配する正確な分子機構を精査することが可能です。実際、立体構造変化は、抗原識別49、50、51の間に役割を果たすことができる方法を示す、非連結TCRの構造を解明するために、このアプローチを使用することも可能です。 TCR-pHLA相互作用を支える非常に複雑で動的な性質をよりよく理解することは、また、治療設計のための明白な意味を持っています。直接修正が抗原recognitioに持って治療標的とされている分子だけでなく、効果を「見る」ことができることnは、明らかに今後これらの薬の開発が向上します。本研究では、高濃度TCRによって係合していない単一のペプチド残基であっても変化は予測できない順に、飛躍的にT細胞認識を変化させる、HLA結合ペプチドの他の残基に構造変化を送信することができることを示しています。ヒト疾患の幅広い将来の治療法を設計する際に、T細胞の抗原認識時に用いられる分子機構のより完全な理解は、非常に有益であろう。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BMは、癌研究英国の博士課程の学生の身分によってサポートされています。 AGは、生命科学研究ネットワークウェールズ博士課程の学生の身分によってサポートされています。 VBは、がん研究ウェールズ博士課程の学生の身分によってサポートされています。 DKCは、ウェルカムトラスト研究キャリア開発フェロー（WT095767）です。 AKSは、ウェルカムトラストの研究者です。 GHMは、関節生命科学研究ネットワークウェールズとTenovusがん医療の博士課程の学生の身分によって運営されています。私たちは、施設やサポートを提供するためのダイヤモンドライトソースのスタッフに感謝します。
Materials
| S.O.C. media | Invitrogen |
| Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo |
| carbenicillin | Sigma |
| IPTG | Fisher |
| Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon |
| Legend RT centrifuge | Sorvall |
| Tris | Fisher |
| magnesium chloride | Arcos |
| NaCl | Fisher |
| glycerol | Sigma-Aldrich |
| Sonopuls HD 2070 | Bandelin |
| DNAse | Fisher |
| Triton | Sigma-Aldrich |
| EDTA | Fisher |
| guanidine | Fisher |
| NanoDrop ND1000 | Thermo |
| Peptides | Peptide Protein Research |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich |
| L-arginine | SAFC |
| cysteamine | Fisher |
| cystamine | Fisher |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich |
| urea | Sigma-Aldrich |
| Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall |
| POROS 10/100 HQ | Applied biosystems |
| ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences |
| 10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius |
| 10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences |
| Phosphate Buffer Saline | Oxoid |
| BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences |
| Biotinylation kit | Avidity |
| BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences |
| CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences |
| streptavidin | Sigma-Aldrich |
| Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences |
| Hepes | Sigma-Aldrich |
| Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments |
| Intelli-plate | Art Robbins Instruments |
| Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions |
| 75 cm2 flask | Greiner Bio-One |
| 0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore |
| Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter |
| Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter |
| CD8 microbeads | Miltenyi Biotec |
| anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen |
| anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec |
| CK medium, PHA | Alere Ltd |
| anti-TCRVβ mAb | BD |
| dasatinib | Axon |
| MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems |
| 51Cr | PerkinElmer |
| 1450 Microbeta counter | PerkinElmer |
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MacLachlan, B. J., Greenshields-Watson, A., Mason, G. H., Schauenburg, A. J., Bianchi, V., Rizkallah, P. J., Sewell, A. K., Fuller, A., Cole, D. K. Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens. J. Vis. Exp. (120), e54991, doi:10.3791/54991 (2017).