Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm
Summary
Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Abstract
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
Introduction
Floresan mikroskobu uzun zebrabalıkları MSS transgenlerin, kalkınma 1 özellikle etkileri etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi beyin gelişimi, kas üretimi, ve diğer birçok gelişimsel olayların 2 katılan hücresel süreçlerin detaylı haritalama izin verdi. Tek bir hücrenin ölümünü incelenmesi esas olarak standart görüntüleme işlemleri sırasında seçici hücre ölümünü teşvik teknik zorluklar, daha zor olmuştur. Ancak, tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ve yüksek hedefli ablasyon tekniklerinin birleşimi sonucu hücre-hücre etkileşimleri yanı sıra, stres ve yaralanma anında hücresel yanıtları soruşturma sağlar. Bu süreçlerin daha iyi anlaşılması, özellikle, nöron glia etkileşimleri ilerlemesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir motor nöron hastalığı (MSB), nörodejeneratif hastalıklar, kritikHastalığın 3.
MSB, ya da Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin sapı, motor korteks ve omurilikteki motor nöronlarını etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nöronların kaybı, kas kaybına yol açar ve hastalar 3 içinde ölür – tanı 4 5 yıl. kas lifleri omurilik renkli motor nöron ve kas kasılması kolaylaştıran bir rol oynamaktadır. Bu nöronların bu iletişim veya ölüm başarısızlığı giderek kasları zayıflatır ve yutmak yürümek, konuşmak ve nefes hastanın yeteneğini etkiler. canlı bir hayvanda bir motor nöron ve kısa vadeli sonuçların ölümünü görselleştirme daha normal hücre homeostazında ve hastalıkta rol dinamik süreçleri anlamak için mükemmel bir fırsat sağlar.
Balığı nörodejeneratif hastalıklar 1 çalışma için cazip bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. BuBu dış döllenme kısa gelişim süresi, sinir sistemine bir optik erişim ve transgenesis kolaylığı gibi, bu model organizma sunduğu avantajlardan kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, kolay bileşiği, transjenik zebrafish oluşturma yeteneği, farklı hücre tipleri çok markalama stratejileri sağlar. Genetik ablasyon spesifik hücre tipleri oldukça geniş rahatsızlık verir, ancak tek tek hücrelerin 5 hedefleme iyi denetim eksikliği öldürmek için yaklaşımlar. Lazer destekli teknikleri, diğer taraftan, ince geçici ve aralıklı kontrolünün sağlar ve farklı hayvan modellerinde kullanılmıştır. Iken gibi çoğu yaklaşımlar kullanmak özel ekipman, lazer yazıcılarını 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ya da iki-foton set-up'lar 13 darbeliaraştırma grupları son zamanlarda geleneksel konfokal mikroskoplar 14 UV lazer avantajı almış.
Burada anlatılan teknik, seçilen motor nöronlarda doza bağlı bir şekilde hücre stres veya ölüme neden UV lazer kaynaklı yaklaşım yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi birleştirir. Bu, hücre kültüründe ve yaşam hayvanlarda başarıyla test edilmiştir yaygın olarak yüklenmiş 405-nm lazer kullanımına dayanır ve bu nöronal ölümünden sonra mikrogliyal açıklık gibi hücresel etkileşimleri, detaylı karakterizasyonu sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lazer Ablasyon Yaklaşımlar
Lazer destekli ablasyon teknikleri hücrelerin bireysel ya da küçük gruplar hassas hedefleme sağlar. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve zebrabalıkları gibi hayvan modellerinde görülen genetik manipülasyonlar ile birleştirme tekniği araştırmacılar sistematik tek bir hücre kaderine ve yaralanma sonrası etkileşimleri çalışma sağlar.
Burada tarif edilen UV (405 nm) lazer ile kesip alma protokolü tek tek hücreler stresli veya öldürülmüş seçici (doza bağlı bir şekilde), nöronlar, glia komşu iken, aksonlar zarar görmeden kalır nasıl özetlenmektedir. Biz başarıyla hücre kültürü deneylerinde bu yaklaşımı kullanılmıştır ve burada Zebra balığı omurilik ayrıntılı bir yaklaşım açıklar var. Biz seçici diğer hücreler (Şekil 5, A ve bir ağ içinde tek bir nöron vurgulayarak Zebra balığı omurilikteki bu yaklaşımın uygulanmasını göstermek <strong> B) ya da hemen ve kurtarma olmayan tek bir nöronu öldürerek (Şekil 5, C ve D).
Daha önce, bu tür darbeli azot lazer ya da iki-fotonlu lazer sistemleri gibi özel lazer sistemleri, doku hasarı ve motor sinir transection 10, 11, 12, 13 oluşturmak için gereken edildi. Bu lazer sistemleri başarıyla tür arterler ve venler 6 tromboz, akut böbrek hasarı 7, kardiyak hasar 8 gibi hücre hasarına, neden ve kalsiyum dalgaları ve beyin hasarı 9 sonra mikrogliyal tepkisini incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, Soustelle ve arkadaşları Drosophila 14 <içinde epitel hasarı ve glial hücreler ikna etmek için geleneksel bir konfokal kurulum (351 nm ve 364 nm UV lazerler) kullanılır/ Sup>.
ALS Anlamak için Zebra balığı Modeller Uygunluk (ve Diğer İnsan Hastalıkları)
Balığı, özellikle gelişim çalışmalarında 28, 29, 30 için, yaygın olarak kullanılan bir model organizma olarak. belli sınırlamalar varken, insan hastalığı modellemek ve patojenik moleküler mekanizmaları bir anlayış vermek için kendi potansiyeli çok büyüktür. Balığı modeller MSB'nin çalışma için iyi kurulmuş ve önemli moleküler Insights 31, 32, 33, 34 yol açmıştır. Transgenik zebrafish hatları hızla oluşturulabilir (4-5 ay) ve belirli bir hücre tipi, onları ALS mevcut hayvan modellerinde değerli bir katkı yapmak özelliklerin seçici izleme sağlar. Zebra balığı embriyolar / larva optik şeffaf ve benzersiz bu deneyimlerden teklifbeyin veya kolayca kemirgen modellerinde elde edilen (ya da insanlarda) olamaz omurilik, tek hücre düzeyinde uzun vadeli canlı görüntüleme sağlayan zihinsel avantajları. Bu tür tek hücreli ablasyonu gibi moleküler teknikler ile kombine edildiğinde, bu in vivo kesin moleküler mekanizmaları çalışmak için eşsiz bir deneysel bir platform sağlar.
Motor Nöronlar Seçici UV Lazer Ablasyonunu kullanma Hedefli Olabilir
Zebra balığı spinal nöronlar doğumdan sonraki 10 saat içinde gelişmeye başlar ve sonra yaklaşık 48 saat 35 36 kurulmuştur. Bu hızlı gelişme, kısa zaman dilimlerinde ve yüksek verimlilik ile bu nöronların görselleştirme sağlar. Motor nöronlar ALS, motor korteks (üst motor nöronlar), beyin sapı ve omurilik (alt motor nöronlar) etkilendiğini, beyin ve kaslar arasında gerekli bağlantıyı sağlamak ve. Bu nöronların kaybı kaçınılmaz mu yol açarSistemik lupus atrofi ve güçsüzlük. Zebrafish omurilikteki motor nöronlar, ayırt edici projeksiyonları tarafından ve -3MNX1 gibi motor-nöron özel promoterlerin kullanımı ile tespit edilebilir. Bu tür çıkıntı nöronların hücre soma Hedefleme zaman (Şekil 4 ve Video 1) üzerinden aksonal projeksiyon boyunca ileriye dejenerasyon saptandı. Spinal motor nöronlarının Tek hücreli çözünürlüklü görüntüleme ayrıca lazer ablasyon (Şekil 4 ve Referans 27 Ek video 3'e bakınız) sonra fosfatidilserin translokasyon ve buna bağlı olarak Annexin V-etiketleme doğruladı. Bizim UV lazer ablasyon yaklaşımı sonra nöronlar ölüyor içinde Annexin V aktivasyonunu rapor olmasına rağmen bu hızlandırılmış süreçte tetiklenir ölüm kaskad tam nörodejenerasyon veya normal hücre homeostazında sırasında meydana nöron ölümünü eşleştiğini, belli olamaz.
Bu ablasyon yaklaşımı son derece tekrarlanabilir ikenve özel, farklı gömme stratejileri de UV ablasyon verimliliğini etkileyebilir. bizim deneyim, biz bizim balık gömülü agaroz katmanı en aza indirmek için en başarılı oldu. nedeniyle zayıflama ve meydana gelen saçılma etkileri sonuçta hücre tarafından alınan UV gücünü azaltabilir yumurta su ilave tabaka ile orta gömme kalın tabakalar ışın yolu boyunca.
Gelecekte, farklı transjenik balık hatlarının kesiştiği lazerle indüklenen hücre yıkımı için, örneğin glia gibi etkilenmiş hücrelerin, tepkileri (12 saat kadar) anında ve kısa dönem gözlenmesi için izin verir. Örneğin, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda astrosit olmayan hücreli bağımsız toksisite araştırması spot edilmiş ve büyük ölçüde düzensiz ve ailesel ALS 37, 38 arasında patojenite rol oynar. Bununla birlikte, mekanizma glial toksisite ve seçicilik yatanMotorun doğru nöronlar belirsizliğini koruyor. Biz ve diğerleri son zamanlarda mikroglia tarafından nöronları ölen yutulmasına incelemek için bu yaklaşımın yararlandı ve nöronal kalıntıları 27, 39, 40 temizlenmesini görüntülendi.
yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve nöro için işaretleri ile ablasyon tekniği birleştiren gelecekte araştırmacılar tek hücre fonksiyonu ve birbirine pili sistemlerinin anlaşılmasını genişletmek için izin verecektir. In vivo ortamda bu işlemlerin karakterizasyonu gelişim ortamlarda hem de hücresel etkileşimler 3 bozulmuş olabilir MSB, 41 dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların, modellerinde, sadece önemlidir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Materials
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
| Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
| Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
| Microscope | Leica | SP5 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Becker, T. S., Rinkwitz, S. Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders. Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).
- Philips, T., Robberecht, W. Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease. Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis. Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845 (2011).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish. J Vis Exp. (76), (2013).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Villegas, R., et al. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Dev. 7, 19 (2012).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy. Neural Dev. 3, 11 (2008).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , (2000).
- Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).
- Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front. Cell. Neurosci. , (2015).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish — emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Lele, Z., Krone, P. H. The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Kabashi, E., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).
- Laird, A. S., et al. Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).
- Lemmens, R., et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).
- Ramesh, T., et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).
- Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo. Development. 103 (1), 49-58 (1988).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Philips, T., Rothstein, J. D. Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 262, 111-120 (2014).
- Mazaheri, F., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nat Commun. 5, 4046 (2014).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).
- Radford, R. A., et al. The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).
