触发细胞应激和死亡使用传统的紫外线激光共聚焦显微镜

注：设计，实施和动物实验报告必须采取的现行准则15帐户。这些工作必须事先经当地动物福利机关批准（在本例中，麦考瑞大学的动物伦理委员会）。 1.准备斑马鱼进行安装和UV细胞消融生成斑马鱼（ 斑马鱼 ）表达荧光蛋白。 以表达在斑马鱼兴趣荧光蛋白质中，执行的质粒注射到斑马鱼蛋的单细胞阶段（如别处16中描述），或使用荧光的转基因株系。标记多种类型的细胞，通过杂交确定转基因系相关于感兴趣的问题创造化合物转基因斑马鱼线。放在晚上假底对配合坦克的每侧一雄一雌斑马鱼和光的发病删除分隔第二天早上（如其他地方17详述）。保持斑马鱼在28℃，并根据所建立的协议17,18处理它们。 通过使劲穿过塑料滤茶含有胚胎水箱收集成功产卵后的胚胎。冲洗鸡蛋与系统中的水，并将其转移到卵水在培养皿中。 检查它们在光学显微镜下，确定施肥。商店受精卵在培养皿中，并放置在孵化器在28°C 18。 可选：执行注射标记特定的细胞群。 注意：这是一种替代方法，允许表达和蛋白质的可视化，而无需提高稳定的转基因系。这种方法也是有利的，当目的蛋白质是有毒的，并禁止了稳定的反式的代基因线。 注入质粒构建到斑马鱼胚胎的单细胞阶段，如别处19，20，21中描述。 注意：此方法导致感兴趣的蛋白的镶嵌表达。感兴趣的蛋白质是从所选择的启动子驱动的由TOL2侧翼（ 例如，islet1 22 -3mnx1 23，24，满足25，或MPEG1 26）反向重复序列20。 鱼的年龄到所需的大小。 提高鱼3 – 5天受精后（DPF），并将其放置荧光化合物显微镜下。屏幕的动物进行适当的荧光表达，选择亮标记的鱼。分开适当的幼虫到另一个菜，鸡蛋水嵌入晚R ON（在28℃培养箱店）。 可选：胚胎可以放入在24小时后受精（HPF）0.2毫1-苯基-2- thioures（PTU）林格溶液来抑制色素沉着的形成。必须小心以PTU，因为它是有毒的，并且可以具有不良生理，遗传，或形态影响。 为在早期发育阶段的研究（<2旦），dechorionate胚胎使用尖锐的镊子手动。酶通过加入链霉蛋白酶（2毫克/毫升）的蛋水，并在28℃培养他们10分钟Dechorionate大量的胚胎。 定期通过胚胎通过塑料巴斯德吸管缓解dechorionation。终止该进程时多数胚胎已经从他们的绒毛膜用鸡蛋水洗他们数次出现。 准备在琼脂糖斑马鱼嵌入解决方案。 加入4克/升MS222制备麻醉溶液（三卡因原液，pH 7.0）中滴加到含有蛋水的培养皿中。 50 mg / L的剂量是建议起点（ 图1A）。 在鸡蛋水 – （1.5％0.8），并将其分装成1.5毫升微量离心管制备低熔点琼脂糖的库存。放置等分试样到预加热的热块（38 – 40℃），并让它平衡到设定的温度（〜30分钟; 图1B）。 可选：对于长期成像（> 4小时），准备35毫米的玻璃底培养皿内的小圆圈琼脂糖，并允许它来设置（ 补充图1）。 注：这个额外的步骤能有效地避免在较长的时间框架与斑马鱼全琼脂糖下降的任何移动。 要做到这一点，沿着玻璃底菜的内圆琼脂糖的地方〜300μL准备一个环形圈在中间一个小口，在其中放置鱼（步骤1.5.3; 补充图1） 。 安装在琼脂糖显微镜的斑马鱼。 选择1 – 3预先筛选鱼消融和转移他们（用移液管）与麻醉液菜麻醉幼虫（步骤1.4.1; 图1C;约5分钟）。 注意：鱼时，他们表现出浅鳃盖运动和降低心脏率麻醉，不再显示触摸诱发逃避反应（TEER;未能游开后，轻轻一刷抚摸自己的尾巴）。保证适当的麻醉鱼的道德治疗，防止抽搐时转入琼脂糖或暴露在荧光灯。 麻醉被确认后，用一个可调移液管（具有截止200μL的尖端设定为〜30微升）吸起来幼虫并让它沉到尖端的底部。通过释放液态与一滴转移幼虫进入预热琼脂糖（步骤1.4.2）幼虫放入琼脂糖（尽量减少蛋水进入琼脂糖的量; 图1D）。 吸上来的鱼琼脂糖包围。很快免除入事先准备好的玻璃底35毫米的菜。 使用解剖显微镜和标准油漆刷（长衬垫，大小1）至琼脂糖内的动物的位置上的一侧（头左侧），使主体和尾都是平（ 图1E）。如果有多个鱼工作，对准所有的鱼的菜，让他们使用的共聚焦显微镜以后容易找到。 注：快速进行定位和调整的这个程序（它可能需要一些练习，因为琼脂糖开始暴露在寒冷的温度后立即设置）。 离开琼脂糖包埋鱼10 – 15分钟，直到琼脂糖设置牢固。小心补足35毫米的培养皿与含有三卡因〜2蛋毫升水（ 图1F）。 2.设置共聚焦显微镜和成像参数放置在培养皿上共聚焦显微镜阶段嵌入式幼虫并专注于动物脊髓背侧（使用亮场）。检查适当的倍率（40X）和荧光设置下的动物和可视化的感兴趣结构（ 例如，标记的神经元或胶质细胞运动的荧光强度），以确认所有的成像参数是根据需要为后续消融（ 图2）。我们经常使用的40倍物镜来执行我们的时间间隔学习。 可选：要进行数小时执行时间推移研究中，最好是记录单个或几个时间点之前消融建立细胞及其环境的未受扰动的生理反应（ 例如，小胶质细胞运动以建立基线速度和运动）。 确定结构的厚度为紫外线激光烧蚀兴趣URE。 使用的z驱动器，通过手动聚焦上下验证感兴趣结构（ 例如，细胞胞体）的顶部和底部。记下z平面将要烧蚀（ 例如，小区的中心）。 注：根据经验，这种方法是通过瞄准那名亮标记的脊髓神经元（高信噪比，使消融后易时移可视化; 例如， 图4）最有效和消融的中间胞体。细胞核荧光能的优势，以确保正确的定位和高效率的消融。 3.在斑马鱼脊髓进行单个细胞的有针对性的激光烧蚀注意：对于这个消融和可视化的方法中，使用共聚焦显微镜（莱卡SP5）。使用405纳米二极管细胞特异性DEST消融过程乱子是根据软件（徕卡应用套件，v2.7.3.9723）的详细。然而，配备了405-nm激光和FRAP（荧光漂白后恢复）或漂白模块任何常规共焦显微镜将允许同一小区的操作的性能，但可能具有稍微不同的设置，参数和名称。 通过单击下拉菜单在软件菜单（ 图3A，1和2）的顶端启动FRAP向导。观察具有不同步骤的新窗口，允许所述特定参数为激光烧蚀设置向上（ 图3B，3）。 通过选择格式，扫描速度（ 图3B，4），和平均确定消融方法的图像参数（ 图3B中 ，5）。在400赫兹和线的扫描速度1,024×1024的图像格式4平均是最适用的。 注意：通常没有必要改变光谱检测（如激发或发射参数），因为他们已经在先前采集被确定。 如果z平面消融尚未选择（如步骤2.4中所述）中，按在“实时”按钮，并通过试样集中直到荧光结构或将要被消融的所需z平面是焦点。 一旦通用图像参数设定，访问“漂白”的步骤（ 图3C，6），以控制特定的消融元件。 注意：激光强度的组合（ 图3C，8），扫描速度，并已在步骤3.2（ 图3B，4和5），以及重复将在设置数被设定的平均化步骤3.5（ 图3E，12）中 ，将确定在ROI内的紫外激光的总停留时间，并因此，漂白效率。 通过激活它的漂白过程（ 图3C，8）接合405-nm激光。 注： – 80％在我们的实验装置与上述设定最成功用405-nm激光强度之间60来实现的。要知道，这种激光的输出功率是仪器专用，并会为每一个共焦设置有所不同。 使用选项中的“放大”（ 图3C，7）通过减少扫描场，因此最大限度地停留时间在选定的投资回报率最大化漂白力度。另外，使用所选择的用于该方法的软件的“漂白点”选项。 通过在图像采集风使用任何的绘图工具选择用于烧蚀一个或多个ROI（ 图3D，10）流（ 图3D，9）。定位的轴突岗，例如具有大约4的圆形绘图工具 – 8微米。 注：消融区域是从一个单一的像素，以更大的面积，这取决于应用可调节的。 建立ROI之后，选择“时间进程”按钮（ 图3E，11）和确认的周期的感兴趣区将被扫描/烧蚀（ 图3E，12）的数量。以根据需要在漂白过程之后刚刚之前，立即使整个图像的概况选择“预漂白”和“后漂白”帧。 建立所有必要的消融参数，按“运行实验”（ 图3E，13）和监测消融后效率。 注：在我们的FRAP设置，单个图像会前，并与合适的激光E中的FRAP周期后拍摄xcitation（ 例如，488纳米的激发对于表达EGFP的细胞）。这些前后消融图片允许的选择消融参数是如何令人满意的投资回报率被漂白的效果如何是一个快速的判断。 通过调整激光强度重复这个过程（ 图3C，8），扫描速度和平均化（ 图3B，4和5），并在壳体的重复（ 图3E，12）所选择的投资回报率仍然示出了完成后的高的荧光强度FRAP周期。 4.执行后续处理，包括鱼“救市”或处置如果实验是终端，安乐死的动物用三卡因的过量。除去蛋水中，并用麻醉原液10分钟更换。为了确保安乐死，检查在显微镜下心跳停止。 可选的：如果实验不是终端，从细镊子和刷子琼脂糖小心取出鱼。放置在新鲜鸡蛋水中鱼，并允许它在观察恢复15分钟。如果正常的游泳行为返回，回鱼的孵化器。 根据该机构的批准的转基因生物废物流处理转基因动物。