İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em> İn Vitro</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
In vitro bütün zar proteinlerinin çalışmalar sıklıkla bir hidrofobik zar geçiş alanına varlığı ile karmaşıktır. Dahası bu çalışmaları komplike, lipozomlar içine deterjan-çözünmüş membran proteinlerinin yeniden birleştirilmesi protein topoloji zorlamak için imkansız bir stokastik süreçtir. Bu kağıt bir lipozom tabanlı iskele kullanan bu zorlu tekniklere alternatif bir yöntem sunuyor. Protein çözünürlüğü transmembran alanının silinmesi ile arttırılır ve bu amino asitler, bir His-etiketi olarak bir bağlama yarımı ile değiştirilir. Bu bağlama Lipozomun yüzeyinde üniform bir protein topoloji zorlar, (nitrilotriasetik asit His-etiketli proteinleri (NTA (Ni2 +)) tarafından koordine Ni 2+) bir ankraj grubu ile etkileşime girer. bütünsel zar proteini, mitokondriyal Fizyon Faktörü (mff) ile Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) arasındaki etkileşim, inve olarak, burada bir örnek sunulmuşturBu yapı iskelesi lipozom yöntemiyle stigated. Bu çalışmada, verimli bir şekilde GTPaz aktivitesi stimüle lipozom yüzeyine çözünebilir Drp1 işe mff yeteneğini göstermiştir. Ayrıca, Drp1 belirli lipid mevcudiyetinde mff dekore edilmiş lipit şablonu tubulate edebildi. Bu örnek, yapısal ve işlevsel tahliller kullanılarak iskele lipozomlar etkinliğini göstermektedir ve Drp1 aktivitesinin düzenlenmesinde mff rolü vurgulamaktadır.
Introduction
Zara yakın protein-protein etkileşimlerini incelemek bağlı 1 dahil bütün zar proteinlerinin doğal ortamından yansıtan zorluk zorlu bir çalışmadır. Bu deterjan, çözündürme gerekliliği ve proteoliposomes protein tutarsız yönlendirmesine bağlıdır. Bu sorunları önlemek için amacıyla, bütün zar proteinlerinin çözünür etki His-Tag füzyon proteinleri olarak ifade edilmiştir, burada bir strateji bulunmaktadır ve bu bu çözünür fragmanları lipid de NTA (Ni2 +) ana grupları ile etkileşimler yoluyla iskele lipozomlara tutturulmuş yüzey. Bu iskeleler kullanılarak, lipid yakın protein etkileşimleri, lipid ve protein bileşimlerinin bir aralığı üzerinde araştırılabilir.
Biz etkili bu pr modüle lipit etkileşimleri mitokondriyal fisyon kompleksinin montajını yöneten kritik protein-protein etkileşimleri araştırmak ve incelemek için bu yöntemi uyguladıkkapsayabilecektir 2. Mitokondriyal parçalanma sırasında Dynamin-ilişkili protein 1 (Drp1) 3 adı verilen bir korunmuş membran yeniden modelleme proteini, enerji homeostazı, apoptotik sinyali ve diğer birçok düzenleyen hücresel sinyallere yanıt olarak dış mitokondriyal zarın (OMM) yüzeyi için görevlendirilir İntegral mitokondrial süreçler. 8 – Bu büyük, sitozolik GTPaz ayrılmaz OMM proteinleri 4 etkileşim yoluyla mitokondri yüzeyine işe alınır. Bu tür bir protein rolü Mitokondrial Fizyon Faktörü (mff), in vitro olarak Drp1 ile belirgin bir zayıf etkileşim aydınlatmak için zor olmuştur. Bununla birlikte, genetik çalışmalar net bir şekilde mff başarılı bir mitokondriyal fisyon 7,8 için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu yazıda anlatılan yöntem Drp1-MFF etkileşimleri teşvik eşzamanlı lipit etkileşimleri tanıtarak önceki eksikliklerin üstesinden gelmek başardı. Genel olarak, bu yeni tahlil reveamitokondriyal fisyon kompleksinin montajını rehberlik temel etkileşimleri açtı ve bu temel moleküler makinenin devam eden yapısal ve işlevsel çalışmalar için yeni bir aşama sağladı.
Bugüne kadar, Drp1 ve mff arasındaki etkileşimlerin incelenmesi mff 9, esneklikleri ile komplike olan, Drp1 heterojenitesi 2,10 polimerler, ve zorluk arındırıcı ve sağlam bir transmembran alanı 11, tam uzunlukta mff yeniden yapılandırmak. Biz onun transmembran (MffΔTM-His 6) eksik His-etiketli MFF sulandırmak için NTA (Ni 2+) iskele lipozomlar kullanarak bu zorlukların ele. E aşırı ifade edildiğinde MffΔTM derece çözünür olduğunu, bu strateji, avantajlı olmuştur. E. coli ve bu izole protein kolayca iskele lipozomlar üzerinde yeniden çözüldü. Bu lipit şablonlarına gergin olduğunda, MFF membran yüzeyinde aynı, dışa bakan yönünü üstlendi.Bu avantajlar, örneğin kardiyolipin gibi mitokondriyal lipidler, ek olarak, membran 11 mff katlama ve sağlam bir yapıya eklenmiştir. Kardiyolipin de bu bozukluğu bölge stabilize etmek ve fisyon makine aksamını kolaylaştırabilir Drp1 2,12 değişken alanı ile etkileşime girer.
Bu sağlam yöntem zara yakın protein etkileşimlerini değerlendirmek istiyoruz gelecek çalışmalar için yaygın olarak uygulanabilir. Ek bağlantısı / afinite etkileşimler kullanımı sayesinde, bu membran yeniden oluşturma çalışmaları sofistike hücreleri içinde membran yüzeyinde bulunan ek karmaşıklık taklit etmek için arttırılabilir. Aynı zamanda, lipid bileşimleri, daha doğru bir şekilde, bu makromoleküler kompleksler doğal ortamları taklit etmek için modifiye edilebilir. Özet olarak, bu yöntem, kritik hücresel proc sırasında membran morfolojileri şekillendirmede göre proteinlerin katkı ve lipidler incelemek için bir araç sağlaresses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, yekpare zar proteinleri içeren, protein-protein etkileşimlerinin araştırılması için bir yöntem sunmaktadır. modüler lipozom iskele kullanarak, araştırmacılar lipid yakın bir ortamda bir veya daha fazla protein aktivitesini değerlendirmek yeteneğine sahiptirler. 26 – Daha önce yapılan çalışmalar, plazma zarının 24 reseptör enzim için de benzer bir yöntem gösterilmiştir. Biz lipit kofaktör birleştirmek ve mitokondriyal fisyon makine mechanoenzymat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) – Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin’s Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
