Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em> In Vitro</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
Studies van integrale membraaneiwitten in vitro worden vaak gecompliceerd door de aanwezigheid van een hydrofoob transmembraandomein. Verdere complicerende deze studies, heropname van wasmiddel-opgeloste membraaneiwitten in liposomen is een stochastisch proces waarbij eiwitten topologie is onmogelijk om af te dwingen. Dit document biedt een alternatieve methode om deze moeilijke techniek die een liposoom gebaseerde scaffold gebruikt. Eiwit oplosbaarheid verbeterd door deletie van het transmembraandomein, en deze aminozuren zijn vervangen door een tethering groep, zoals een His-tag. Deze tuier interageert met een verankerende groep (Ni2 + gecoördineerd door nitrilotriazijnzuur (NTA (Ni2 +)) voor His-gelabelde eiwitten), waarbij een uniforme eiwit topologie dwingt aan het oppervlak van het liposoom. Een voorbeeld wordt gepresenteerd, waarin de interactie tussen-Dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1) met een integraal membraaneiwit, Mitochondriale Fission Factor (MFK), was investigated met behulp van deze steiger liposoom methode. In dit werk hebben we het vermogen van MFK oplosbare Drp1 efficiënt rekruteren op het oppervlak van liposomen, waarvan de GTPase activiteit gestimuleerd aangetoond. Bovendien Drp1 was in staat om het MFK-versierde lipide-template in de aanwezigheid van specifieke lipiden buisvormig maken. Dit voorbeeld toont de effectiviteit van scaffold liposomen middels structurele en functionele assays en wordt de rol in het reguleren van MFF Drp1 activiteit.
Introduction
Bestuderen membraanproximale eiwit-eiwit interacties is een uitdagende poging door problemen als gevolg indient de natuurlijke omgeving van het integrale membraaneiwitten betrokken 1. Dit komt door de noodzaak detergens oplosbaar en inconsistente oriëntatie van eiwitten in proteoliposomen. Om deze problemen te voorkomen, hebben we een strategie waarbij oplosbare domeinen van integrale membraaneiwitten zijn uitgedrukt His-tag fusie-eiwitten toegepast, en deze oplosbare fragmenten zijn verankerd aan scaffold liposomen via interacties met NTA (Ni2 +) kopgroepen van het lipide oppervlak. Met deze steigers, kunnen lipide-proximale eiwitinteracties worden onderzocht over een traject van lipiden en eiwitten samenstellingen.
Wij hebben effectief pasten deze methode het kritische eiwit-eiwit interacties die assemblage van de mitochondriale complex splitsing regelt onderzoeken en onderzoeken lipide interacties die deze pr modulerenocess 2. Tijdens mitochondriale splitsing, een geconserveerd membraan remodeling eiwit, genaamd-Dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1) 3 wordt aangetrokken naar het oppervlak van de buitenste mitochondriale membraan (OMM) in reactie op cellulaire signalen die energie homeostase, apoptotische signalering, en verscheidene andere reguleren integraal mitochondriale processen. Deze grote cytosolische GTPase wordt aangetrokken naar het oppervlak van mitochondria door interactie met geïntegreerde OMM eiwitten 4-8. De rol van een dergelijk eiwit, Mitochondriale Splitsing Factor (MFF), moeilijk op te helderen als gevolg van een schijnbare zwakke interactie met Drp1 in vitro. Desondanks hebben genetische studies duidelijk aangetoond dat MFK essentieel voor een succesvolle mitochondriale kernsplijting 7,8. De methode in dit manuscript beschreven was in staat om eerdere tekortkomingen te verhelpen door de invoering van gelijktijdige lipide interacties die Drp1-MFF interacties te promoten. Over het algemeen, deze roman assay REVEAgeleid fundamentele interacties begeleiden van assemblage van het mitochondriale kernsplijting complex en voorzien van een nieuwe fase voor de lopende structurele en functionele studies van deze essentiële moleculaire machine.
Tot op heden zijn onderzocht interacties tussen Drp1 en MFF bemoeilijkt door de inherente flexibiliteit van MFF 9, de heterogeniteit van Drp1 polymeren 2,10, en de moeilijkheid bij het zuiveren en reconstitutie full-length MFF met intact transmembraandomein 11. We gericht deze uitdagingen met behulp van NTA (Ni 2+) steiger liposomen His-tag MFF reconstrueren ontbreekt haar transmembraandomein (MffΔTM-His 6). Deze strategie is voordelig omdat MffΔTM was zeer oplosbaar toen over-uitgedrukt in E. coli, en deze geïsoleerde eiwit was gemakkelijk gereconstitueerd op steiger liposomen. Wanneer deze gebonden lipiden sjablonen, MFF verondersteld een identieke, naar buiten gerichte oriëntatie op het oppervlak van het membraan.Naast deze voordelen, mitochondrial lipiden, zoals cardiolipine, werden toegevoegd aan MFF vouwen en associatie stabiliseren het membraan 11. Cardiolipine ook interactie met het variabele domein van Drp1 2,12 waarvan de ongeordende gebied kan stabiliseren en assemblage van de splitsing machine te vergemakkelijken.
Deze robuuste methode is breed toepasbaar voor toekomstige studies die streven naar het membraan-proximale eiwit interacties te evalueren. Door het gebruik van aanvullende tethering / affiniteit interacties, kan de complexiteit van deze membraan reconstitutie studies worden verbeterd om verder compliceren vinden op het oppervlak van membranen in cellen nabootsen. Tegelijkertijd kunnen lipidesamenstellingen worden gemodificeerd om nauwkeuriger na te bootsen de natuurlijke omgeving van deze macromoleculaire complexen. Kortom, deze werkwijze verschaft een middel om de relatieve bijdragen van eiwitten en lipiden in vormgeving membraan morfologie om tijdens kritieke cellulaire proc onderzochtsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van eiwit-eiwit interacties van integrale membraaneiwitten. Met behulp van een liposoom modulaire steiger, onderzoekers zijn geschikt om de activiteit van één of meer eiwitten in een lipide-proximale omgeving. 26 – Eerdere studies hebben een soortgelijke werkwijze voor receptor enzymen van de plasmamembraan 24 aangetoond. We hebben deze methode om lipide co-factoren op te nemen en interacties tussen eiwitten die deel uitmaken van de m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) – Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin’s Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
