باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em> في المختبر</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
في كثير من الأحيان معقدة دراسات للبروتينات الغشاء لا يتجزأ في المختبر عن طريق وجود مجال الغشاء مسعور. يزيد من تعقيد هذه الدراسات، إعادة إدماجهم في الحياة من البروتينات الغشاء المنظفات بالفاعلات في الجسيمات الشحمية هي عملية العشوائية حيث طوبولوجيا البروتين من المستحيل تطبيقها. تقدم هذه الورقة طريقة بديلة لهذه التقنيات الصعبة التي تستخدم سقالة القائم على الحويصلية. ومما يعزز الذوبان البروتين عن طريق حذف المجال عبر الغشاء، ويتم استبدال هذه الأحماض الأمينية مع شاردة الربط، مثل صاحب العلامة. هذا الحبل يتفاعل مع مجموعة ترسيخ (ني 2+ بتنسيق من حمض nitrilotriacetic (NTA (ني 2+)) لصاحب الموسومة البروتينات)، التي تفرض طوبولوجيا البروتين موحد على سطح الجسيمات الشحمية. ويقدم مثالا حيث التفاعل بين ذات الصلة Dynamin بروتين 1 (Drp1) مع بروتين الغشاء لا يتجزأ، الميتوكوندريا الانشطار عامل (MFF)، وكان إنفيstigated استخدام هذا الأسلوب سقالة الحويصلية. في هذا العمل، لقد أثبتنا قدرة MFF لتجنيد بكفاءة Drp1 القابلة للذوبان على سطح الجسيمات الشحمية، الأمر الذي حفز النشاط GTPase لها. وعلاوة على ذلك، كانت قادرة على tubulate القالب الدهون زينت MFF في وجود الدهون محددة Drp1. يوضح هذا المثال فعالية الجسيمات الشحمية سقالة باستخدام فحوصات الهيكلية والوظيفية ويسلط الضوء على دور MFF في تنظيم النشاط Drp1.
Introduction
دراسة تفاعلات البروتين البروتين غشاء الداني هو مسعى صعبة بسبب صعوبة تلخص البيئة الأصلية للبروتينات الغشاء لا يتجزأ المشاركة 1. ويرجع ذلك إلى ضرورة إذابة المنظفات والتوجه يتعارض البروتينات في proteoliposomes هذا. من أجل تجنب هذه القضايا، ونحن قد استخدمت استراتيجية حيث يتم التعبير عن المجالات القابلة للذوبان من بروتينات الغشاء لا يتجزأ كما بروتينات اندماج صاحب العلامة، وترتكز هذه الشظايا القابلة للذوبان في الجسيمات الشحمية سقالة عبر التفاعل مع الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) headgroups في الدهون سطح. باستخدام هذه الاطر، وتفاعلات البروتين الدهني الداني يمكن التحقيق على مجموعة من الدهون والبروتين التراكيب.
ولقد طبق فعليا هذا الأسلوب لتحقيق تفاعلات البروتين البروتين الحرجة التي تحكم التجمع من مجمع الانشطار الميتوكوندريا ودراسة التفاعلات الدهون التي تعدل هذه العلاقات العامةocess 2. أثناء الانشطار الميتوكوندريا، وهو محفوظ البروتين غشاء إعادة عرض، ودعا المتعلقة Dynamin بروتين 1 (Drp1) 3، ويتم تجنيدهم للسطح الخارجي الميتوكوندريا غشاء (OMM) استجابة لإشارات الخلوية التي تنظم توازن الطاقة، مما يشير أفكارك، وعدد آخر عمليات الميتوكوندريا لا يتجزأ. يتم تجنيد هذا كبير، GTPase عصاري خلوي إلى السطح من الميتوكوندريا من خلال التفاعل مع بروتينات OMM لا يتجزأ 4-8. وقد كان دور واحد مثل البروتين، الميتوكوندريا الانشطار عامل (MFF)، من الصعب توضيح بسبب ضعف التفاعل الواضح مع Drp1 في المختبر. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات الجينية بوضوح أن MFF أمر ضروري لنجاح 7،8 الانشطار الميتوكوندريا. وكان الأسلوب هو موضح في هذه المخطوطة قادرة على التغلب على أوجه القصور السابقة عن طريق إدخال التفاعلات الدهون المتزامنة التي تعزز التفاعلات Drp1-MFF. عموما، هذه الرواية فحص reveaأدت قوة أساسية تجميع المجمع الانشطار الميتوكوندريا توجيه وقدمت مرحلة جديدة للدراسات الهيكلية والوظيفية لهذه الآلة الجزيئية الأساسية.
حتى الآن، دراسة التفاعلات بين Drp1 وMFF وتعقدت من المرونة المتأصلة في MFF 9، عدم تجانس Drp1 البوليمرات 2،10، وصعوبة في تنقية وإعادة تشكيل كامل طول MFF مع مجال الغشاء سليمة 11. تناولنا هذه التحديات باستخدام الجسيمات الشحمية NTA (ني 2+) سقالة لإعادة صاحب الموسومة-MFF تفتقر نطاق الغشاء لها (MffΔTM-صاحب 6). وكانت هذه الاستراتيجية مفيدة لMffΔTM كان ذوبان للغاية عند الإفراط في المعبر عنها في البريد. القولونية، وهذا البروتين المعزول أعيد بسهولة على الجسيمات الشحمية سقالة. عندما المربوطة إلى هذه القوالب الدهون، يفترض MFF ومتطابقة، في مواجهة الخارج التوجه على سطح الغشاء.وبالإضافة إلى هذه المزايا، والدهون الميتوكوندريا، مثل كارديوليين، أضيفت إلى استقرار MFF قابلة للطي وبالتعاون مع غشاء 11. يتفاعل كارديوليين أيضا مع المجال متغير من Drp1 2،12 والتي قد استقرار هذه المنطقة المضطربة وتسهيل تجميع الآلات الانشطار.
هذه طريقة قوية غير قابلة للتطبيق على نطاق واسع للدراسات المستقبلية التي تسعى إلى تقييم تفاعلات البروتين غشاء الداني. من خلال استخدام التفاعلات إضافية الربط / تقارب، وتطور هذه الدراسات غشاء إعادة يمكن تعزيز لتقليد تعقيد إضافي وجدت على سطح الأغشية داخل الخلايا. في نفس الوقت، والتراكيب الدهون يمكن تعديلها لتحاكي بدقة أكثر البيئات المحلية من هذه المجمعات الجزيئات. وخلاصة القول، وهذه الطريقة توفر وسيلة لدراسة المساهمات النسبية للبروتينات والدهون في تشكيل الأشكال التضاريسية غشاء إليها أثناء بروك الخلوي حرجةesses.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول وسيلة لتحقيق البروتين البروتين التفاعلات التي تنطوي على بروتينات الغشاء لا يتجزأ. من خلال الاستفادة من سقالة الحويصلية وحدات، والمحققين قادرون على تقييم نشاط البروتينات واحد أو أكثر في بيئة الدهون القريب. وقد أظهرت دراسات سابقة طريقة مماثلة للأ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) – Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin’s Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
