Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.
Мы представляем два минимально инвазивные микрохирургической техники у грызунов специфической доставки лекарств в среднее ухо так, что она может достичь внутреннего уха. Первая процедура состоит из перфорации барабанной буллы, названный bullostomy; второй является transtympanic инъекции. Оба эмулировать клинические процедуры человека находящийся в барабанной полости.
Хитозан-глицерофосфат (CGP) и Ringer's Лактат буфер (RL), были использованы в качестве биологически совместимых транспортных средств для местной доставки лекарственных средств. CGP представляет собой нетоксичный биоразлагаемый полимер, широко используемый в фармацевтических применениях. Это представляет собой вязкую жидкость при комнатной температуре, но застывает до полутвердого твердой фазе при температуре тела. RL представляет собой изотонический раствор, используемый для внутривенного администрации в организме человека. Небольшой объем этого автомобиля точно помещается на круглое окно (RW) нише с помощью bullostomy. Transtympanic инъекции заполняет среднее ухо и позволяет меньше контроля, но более широкий доступ к внутреннему уху.
<p class = "jove_content"> были изучены и сопоставлены с помощью функциональных и морфологических тестов профили безопасности обоих методов. Слух оценивали путем регистрации слуховом стволомозговые Response (ABR) до и несколько раз после микрохирургии. Цитоархитектуры и сохранение уровня кохлеарных структур были изучены с помощью обычных гистологических методов в параформальдегидом фиксированной и декальцинированной кохлеарных образцов. Параллельно нефиксированные кохлеарные были взяты образцы и немедленно замораживали, чтобы проанализировать профили экспрессии генов маркеров воспаления с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (QRT-PCR).Обе процедуры пригодны в качестве способов доставки лекарственных средств в мышь среднего уха, хотя transtympanic инъекции оказались менее инвазивным по сравнению с bullostomy.
Нарушение слуха является наиболее частым сенсорно дефицита человека и влияет на 5,3% мирового населения и 30% лиц в возрасте старше 65 лет ( http://www.who.int/topics/deafness/en~~HEAD=pobj , обновление 2016 г.). Потеря слуха влияет на приобретение языка у детей и ускоряет снижение когнитивных функций у пожилых людей. Таким образом, это является серьезной проблемой здравоохранения с огромным социально-экономическим последствиям. Это может быть вызвано генетическими дефектами, факторы окружающей среды или сочетанием обоих 1, что , в конце концов вызывает повреждение и гибель клеток волос и нейронов в улитке. Эти клетки не восстанавливаются в организме млекопитающих, поэтому клеточная потеря и сопутствующая потеря слуха не может быть отменено. Клинические варианты основаны на протезах, в том числе слуховых аппаратов и кохлеарных, среднего уха и имплантатов костной проводимости 2. К сожалению, нет никакой конкретной медицинской восстановительное Треаtments для слуха и, таким образом, несколько исследовательских линий сосредоточены на разработке профилактических и репаративной терапии. Новые терапевтические варианты включают генной и клеточной терапии, а также развитие малых молекул для фармакологической терапии 2.
Одной из наиболее важных проблем в кохлеарного фармакологической терапии для доставки лекарственных средств. Системное лечение имеют ограниченную эффективность в улитке из – за кроваво-лабиринтного барьеру 3, непрерывное эндотелий в контакте с кохлеарный кровеносных сосудов, который действует в качестве физического и биохимического барьера для поддержания внутреннего гомеостаза жидкости уха, тем самым ограничивая проход лекарственного средства для внутреннего уха. Он проницаем только для небольших жирорастворимых соединений, хотя проницаемость может быть увеличена во время кохлеарного воспаления, а также с использованием мочегонных или осмотических агентов. Объем препарата, который в конечном итоге достигает улитку после того, как системное введение снижается;Таким образом, высокие дозы, которые могут привести к органической токсичности необходимы. Кроме того, печеночный метаболизм препарата может образовывать токсичные или неактивных метаболитов 4, 5, 6, 7. В отличие от этого , местные вмешательства позволяют размещать известного ограниченного количества лекарственного средства в среднее или внутреннее ухо без нежелательных побочных эффектов 4, 7, 8, 9. В современной клинической практике, находящийся в барабанной полости администрации ограничены определенными кохлеарные патологий, таких как гентамицин при болезни Меньера 10, кортикостероиды внезапной глухоты, болезни Меньера, иммуноопосредованную и шума потери слуха в результате , 11, 12, 13, 14, 15 и инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF1) в внезапной глухоты 4, 16, 17.
Препараты для местной администрации должны сохранить хрупкое гомеостаз (рН и осмолярности) кохлеарной жидкостей. Кроме того, очень важно, чтобы поддерживать стерильность в течение всего процесса, чтобы избежать бактериального загрязнения спинно-мозговой жидкости. Наполнитель используется для доставки лекарственного средства должен быть биологически совместимым, nonototoxic и соответствующей консистенции. Жидкие растворы рекомендуются для intracochlear инъекций, но не пригодны для находящийся в барабанной полости маршрута из-за зазора через евстахиеву трубу. В этом случае препараты обычно переносятся полутвердые гели для повышения их свойств в среднем ухе , 4, 18, 19. Альтернативная доставка систмс , используемые в качестве носителей для увеличения прохождение препарата внутреннего уха являются наночастицы 20 и аденовирусы 21 Здесь мы сравнили два транспортных средства: CGP и раствора Рингера. CGP представляет собой гидрогель, образованный хитозана, линейный полисахарид, состоящий из D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, полученного из панцирей ракообразных, а также бета-глицерофосфат, полиола, который образует щит воды вокруг хитозана цепей и поддерживает его в жидкая форма. CGP является термочувствительным и может быть понижена лизоцимы, что позволяет обеспечивать непрерывное высвобождение лекарств в среднем ухе 22, 23, 24, 25. Хитозан-база гидрогели являются подходящими транспортные средства для клинических применений , таких как доставки лекарств из – за их отсутствия иммуногенности и отсутствия активации местных воспалительных реакций 23, 24. На дрэр стороны, буфер RL является непирогенными изотонический раствор (273 мОсм / л и рН 6,5), предназначенных для внутривенного введения в организме человека как источник воды и электролитов, особенно в кровопотери, травмы или ожогам из-за побочных продуктов лактата метаболизма в печени противодействовать ацидоз.
Здесь мы описываем и сравнить два хирургических методов, которые были усовершенствованы для локальной доставки лекарственного средства к мыши внутреннего уха. Профиль безопасности обоих методов оценивали с помощью функциональных, морфологических и молекулярных тестов. Слух оценивали с помощью Слуховые Ответ головного мозга (ABR) 26, 27 выполнены до и после микрохирургии в разное время. Процедуры конечной точки были использованы для рассекают улитку и сравнить анатомический, клеточный и молекулярный влияние этих двух микрохирургических процедур.
Местные доставки лекарственного средства к внутреннему уху может быть сделано непосредственно intracochlear инъекции или косвенно введения находящийся в барабанной полости, помещая препарат в среднем ухе 4, 19, 39. Intracochlear администрация обеспечивает контролируемое и точное доставки лекарственного средства к улитке, избегая диффузии через окно мембран, базальных к верхушечный градиенты концентрации и зазор через евстахиеву трубу. Тем не менее, это, как правило , весьма инвазивной процедурой , которая требует сложной и деликатной микрохирургии 7, 39. В этом контексте, промышленность разрабатывает новые, с покрытием, имплантируемые устройства для замедленного высвобождения лекарственного средства 40, 41. С другой стороны, введение является находящийся в барабанной полости минимально инвазивной и легко выполнить процедуру, которая дает возможность вдувать больших объемов Дковрике в среднее ухо, хотя фармакокинетика не так легко контролировать. Большинство препарата очищается через евстахиеву трубу , а оставшаяся доля должна диффундировать через мембрану RW для достижения улитку 18. RW является местом максимального поглощения веществ из среднего уха в перилимфе заполненные барабанной канала улитки 7. Это полупроницаемой структура три слоя, хотя ее проницаемость зависит от характеристик наркотиков (размер, концентрации, растворимость и электрического заряда) и трансмембранный транспортных систем (диффузия, активный транспорт или фагоцитоз) 42. Овальное окно и ушные капсулы являются альтернативными , но менее эффективные входы в улитке 43, 44.
Здесь мы показываем, и сравнить два микрохирургические методы адресной доставки лекарств в мышь среднего уха: bullostomy и transtympaПроцедуры NIC инъекции. Общие критические шаги к этим процедурам относятся: я) оценку слуха до и после микрохирургии, б) получение однородного раствора носителя в стерильных условиях, III) тщательный контроль за обезболивающий процедуры и контроль температуры тела животных и констант, IV ) медленное размещение соответствующего объема транспортного средства с таргетингом на RW, и IV) принимать кохлеарные образцы для завершения молекулярного и морфологического анализа.
Позадиушной и брюшные подходы к bullostomy были описаны 7, 45. Мы использовали вентральной приближение , потому что в нашем опыте это привело к снижению заболеваемости и обеспечили более широкий доступ к RW 46. Transtympanic инъекции обычно проводят через Рагз TENSA барабанной перепонки, передней или задней к молоточка 12 рукоятки. Вэто работа , которую мы провели модификацию методики, инъекции через Pars flaccida за пределами молоточка с предыдущим дополнительным пункции Парс TENSA , чтобы позволить воздуху эвакуацию во время инъекции.
Transtympanic инъекция была менее агрессивна, чем bullostomy, хотя оба микрохирургические были быстрые (20 и 5 мин на ухо для bullostomy и transtympanic подхода соответственно), с короткими послеоперационными раза восстановления сил и отсутствие заболеваемости. Самое главное, что обе процедуры слуха и благоустроенный параметры ABR были идентичны тем, которые определены до микрохирургии. Transtympanic подход занимает меньше времени, чем bullostomy и могут быть выполнены в обоих ушах одного и того же животного в течение того же вмешательства. Преимущества transtympanic инъекции, таким образом, что она может быть выполнена на двусторонней основе, и повторяться, если это необходимо. С другой стороны, bullostomy обеспечивает прямой визуальный доступ к мембране RW и позволяет Filliнг нишу RW. В отличие от этого, transtympanic инъекции не допускает контроль размещения транспортного средства в нише RW.
Процедуры, приведенные в этой работе описывают, как выполнить доставку местное лекарственное средство транспортное средство в среднее ухо для доклинических приложений, таких как оценка ототоксичность и оценки эффективности при потере слуха. Две процедуры микрохирургии описаны, которые обеспечивают альтернативные методы с определенными преимуществами и недостатками. Оба сохраняют слух и не вызывают морфологические изменения. Местное воспаление описывается как потенциальное осложнение bullostomy. Набор дополнительных методов описаны также для послеоперационных процедур, в том числе слуха, морфологических и воспалительных оценок экспрессии маркеров. Будущие приложения для этих методов включают доклинической оценки новых методов лечения для потери слуха, в том числе генетических, клеточных и фармакологических подходов, на животных моделях. administrat находящийся в барабанной полостиионы обеспечивают доставку лечения в среднем ухе, в контакте с круглым мембраной окна, облегчая проход в перилимфой без очевидного кохлеарного повреждений.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность Genomics и сооружения неинвазивный нейрофункциональной оценки (IIBM, CSIC-UAM) за техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами испанской "Ministerio де Economia у Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) и Европейского Союза (FP7-AFHELO и FP7-PEOPLE-TARGEAR) к IVN.
Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
Water pump | Gaymar | # TP472 | |
Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
Statistics software (SPSS) | IBM | ||
Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion and respiratory and skin sensitizer |
Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed one hour. |
Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
Pividone iodine based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
Microlance 27G | Becton Dickinson | # 302200 | |
Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
Catheter (Microfil 34G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |