乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

この記事のすべての動物の手順を見直し、オレゴン健康科学大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 手術領域と楽器の作製 30分間124℃でオートクレーブではさみ、ピンセット、および止血剤を準備し、1 – 計画された手術の2日前。手術後の回復のためのオートクレーブ滅菌または滅菌寝具、ケージ、および食料へのアクセスを確認してください。 好ましくは、層流フードで、無菌手術領域を準備します。 10％の加熱パッド、光源、麻酔チューブとノーズコーンを含む漂白剤、及びそれが実行されている間に外科手術に近接なり手術室の他の部分と手術領域の全ての表面を拭います。 無菌手術領域では、滅菌ドレープ、光源、麻酔チューブおよびノー​​ズコーン、インスリン注射器で洗浄、加熱パッドを配置1cm 2の小片、はさみ、鉗子、止血剤、4-0ビクリル縫合糸- 0.5にカットし、1ミリリットル注射器、ブピバカイン、人工涙液、滅菌生理食塩水、2×2」、滅菌ガーゼスポンジ、4×4 "滅菌ガーゼ、止血ガーゼオートクレーブ処理容器内のテーパー針、および50ミリリットルの2％グルコン酸クロルヘキシジンと。 氷の上に保存されている準備された腫瘍細胞のために、このスペースに余裕があることを確認してください。 手術領域に隣接したベンチに、第二の加​​熱パッドと滅菌寝具付きの清潔なケージでリカバリ領域を準備します。 注：このエリアには、例えばビーズ滅菌器などの項目を収容することができます。 2.ポータル静脈注射疼痛管理のために皮下0.015 mg / mlでブプレノルフィン、100μlのと15週、 – 計画された注射への一時間前、8高齢者のBalb / c雌マウスを扱います。 注：この注入プロトコルは、適切なを使用して、任意の年齢で女性または男性マウスの任意の株にも適用することができます株への変更のための細胞株。 選択した細胞株または腫瘍外植片のためのプロトコルに基づいて、注射のための腫瘍細胞を準備します。動物コロニーに、そのような病原体を導入するリスクを低減するために、マウスの病原体の存在のために、投与前に、すべての腫瘍細胞株をテストします。 3日間注射前に10cmの組織培養プレートにD2A1、D2.OR、および4T1腫瘍細胞、解凍細胞を含む同系のBalb / cの腫瘍細胞株のためのそのような翌日、細胞は約90であることを – 100％コンフルエント。 1日1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回、腫瘍細胞融解洗浄細胞を次の5分間、37℃で、0.05％トリプシンを2mlを用いて、コンフルエント腫瘍細胞をトリプシン処理。完全培地10mlの新鮮な10cmディッシュに8の完全培地ミリリットル（DMEM高グルコース、10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン）および通路1:10加えます。 注射の日に、1×PBSおよびトンで細胞を1回洗浄上記のようにrypsinize。 再懸濁し、5mlの1×PBS中にメディアを再懸濁を削除し、1500×gで5分間スピン、完全培地8mlに細胞をトリプシン処理しました。 生存能力評価のためのトリパンブルー排除を使用して、血球計数器上の細胞を数えます。事前に決定された濃度と体積で1×PBSでの注射のために細胞を再懸濁します。 注：5 – 小さい注入量は、肝臓への不要な損傷を防ぐように10μlを推奨します。 注射の期間中、氷上で細胞を保管してください。注射の完了後、生存能力を確保するために、1日の完全培地中で培養中の研究室への細胞のサンプルを返して置きます。 酸素で配信2.5％イソフルラン（2-クロロ-2-（ジフルオロメトキシ）-1,1,1-トリフルオロ – エタン） – 2で麻酔下にマウスを置きます。加熱パッドを使用して体温を維持。つま先のピンチに反応するために評価することにより、完全な麻酔を確認し、anestheを維持2.5％のイソフルラン – 2でSIA。 注：呼吸数の動物を監視し、手順全体応じイソフルラン流量を調整することが重要です。 外科手術中に目の過度の乾燥を避けるために、それぞれの目の上に人工涙液または獣医軟膏の少量を置きます。 露出した腹部とその背中に、仰臥位でマウスを置きます。 化学脱毛の領域を拭いて4 番目の鼠径部乳腺の乳首まで第2リブ空間から齧歯類の腹左側に髪を削除します。 2分した後、この手順は1行うことができガーゼとH 2 Oで完全に削除- -数多くの手術が予定されている場合は、時間を節約するために、事前に2日間脱毛は1のために座ってできるようにします。 （2％クロルヘキシジンに浸した）1 2×2 "滅菌ガーゼスポンジを取り、脱毛部位にマウスを拭いてください。全体の周囲を滅菌、尾を含め、細菌続きを最小限にするために楽器のアミノ化。 脱毛の部位とアルコールの準備パッドとダウン周辺エリアを拭いてください。 もう一度2％クロルヘキシジンとアルコールの手順を繰り返し、最終的なクロルヘキシジンで仕上げ3 2％クロルヘキシジンおよび2アルコールプレップパッドの洗浄の合計のために拭いてください。最終クロルヘキシジンは、化学物質が内臓にクロルヘキシジンとなることを避けるために、手術部位の周りに滴下しないように拭いてください。注：クロルヘキシジンアルコール皮膚および周囲の毛の大量のアプリケーションの体温の有意な低下をもたらし得ます。ステップ2.7から2.9の間に過剰量で拭かないでください。加熱パッドで体温を維持。 滅菌手袋、滅菌刃で滅菌メスを用いて、マウスの左側の中央値と矢状面との間の皮膚への単一の1インチの切開を行い、ちょうど肋骨の下から始まり、ちょうど第四鼠径部の平面の上に終わります乳腺乳頭。 オートクレーブ処理またはビーズ滅菌ハサミやピンセットを使用して、腹腔に類似した1インチの切開を行います。乳房脂肪パッドに切断避け、腸、肝臓、または横隔膜をカットしないように確認してください。 切開は、内部器官をガーゼの上に置き、周囲の皮膚または手術部位に接触しないことができるようになされた、マウスの左側の滅菌生理食塩水に浸漬した4×4 "ガーゼパッドを置きます。 腫瘍細胞は、マウスの準備中に沈降するように上下に数回ピペッティングにより腫瘍細胞を準備します。腫瘍細胞を25μlの取り外し可能な針注射器および32ゲージの針を準備します。腫瘍細胞が針の先端にあり、プランジャが注射のための適切な音量になるまで注射器に押し込みます。気泡の注入を避けます。 任意の外部腫瘍細胞を除去するために、無菌のアルコールパッドで針の外側を拭いてください。針刺しを回避するために、十分に注意してください。 中央値SIDを保持しますさておき鉗子で皮膚および腹膜ライニングを含む切開の電子と、慎重に滅菌生理食塩水に浸した滅菌ガーゼ上に置く、大腸及び小腸を引き出すために滅菌綿棒を使用しています。門脈が可視化されるまで、大腸及び小腸を引き出します。 内部の水分や無菌性を維持するために生理食塩水に浸したガーゼで臓器をカバーしています。 また、滅菌手袋を着用し、アシスタントを持って、静かに滅菌綿が完全に門脈を明らかにするために綿棒をひっくり返して邪魔にならないように生理食塩水に浸したガーゼに包まれた腸を保持します。さらに、切開部の中央側の脇に組織を保持するために、オートクレーブ止血鉗子または鉗子を使用する必要があるかもしれません。 傘を上に向けて、静脈に5°<角度で肝臓下の10ミリメートル〜門脈に5ミリメートル – 〜3腫瘍細胞を装填した針を挿入します。ゆっくりと腫瘍細胞を含むフル・ボリュームを注入します。血液が針の時間を過ぎて流れることを可能にします静脈からの腫瘍細胞の逆流を避けるために数秒間EAD。注入中の静脈に針を動かす最小限に抑えます。ここでも、針刺しを回避するために注意してください。 注：好ましい場合、門脈の可視化倍率なしで行われ、ただし、立体顕微鏡を使用してもよいです。 同時に圧力で静脈に滅菌綿棒を配置しながら、針を外します。静脈に注射部位の上に1cm 2の止血ガーゼ-アシスタントがまだわき腸を保持して0.5の1枚を配置します。 注：止血粉は、プロトコルのこのステップのためにしようとしましたが、注射後の静脈血の損失を止めるのに効果的ではなかったです。 5分間の滅菌綿棒からの圧力で、注射部位での止血ガーゼを保持します。 ガーゼは、周囲の組織にsteril少量のスティック場合は、慎重に止血ガーゼを持ち上げて静脈の閉鎖を評価しますE生理食塩水を浸漬し、ガーゼを持ち上げるために使用することができます。 血液の損失がこの時点で発生した場合は、さらに5分間圧力を持つサイトでの止血ガーゼの追加部分を配置します。血流が完全に停止したときに、マウスからガーゼを除去します。 注：外科的処置中の血液損失は慎重にマウスがしばらく心臓灌流によって、麻酔下で安楽死させなければなりません評価し、合計許可血液損失量に達するか超えた場合（研究者の治験審査委員会の規制標準操作手順に基づいて）する必要があります。 注射部位は、注射部位を残していない血液で、そのままと判断すると、静かに戻って腹腔内に内臓を配置します。 腹膜ライニングと、単純な連続または結節縫合パターンを用いて、滅菌4-0ビクリル縫合糸とテーパー針で皮膚を縫合。一般的に、切開部を閉鎖することは10-15縫合が必要です。 bupiの100μLを注入しますインスリン注射器を用いて局所疼痛管理のための切開部位に沿ってvacaine（5 mg / mlで）。滅菌生理食塩水を皮下水和26ゲージ針を有する1mLの注射器を用いて0.5mlのを注入します。完了するまでに25分 – 手術は15を取ります。 手術全体の無菌状態を維持するために、手袋をはめた手を含め、すべてのツールや材料をマウスに接触していることを確認し、接触する前に適切に洗浄されます。可能な場合は使用無菌材料と手袋、または最小限にきれいにする70％エタノール溶液または10％の漂白剤溶液を利用します。 複数の手術は、単一のセッションのために計画されている場合は0.5に、新しい滅菌ドレープ、インスリン注射器で1ミリリットル注射器、滅菌生理食塩水、2×2」、滅菌ガーゼスポンジ、4×4 "滅菌ガーゼ、止血ガーゼカットを最初の手術領域をリメイク – 1cm 2の個、テーパー針で4-0ビクリル縫合糸、および2％のクロルヘキシジン。手術の間にはさみ、鉗子、止血剤をビーズ滅菌および許可適切に再利用する前に冷却します。 3.げっ歯類の健康を監視回復、およびエンドポイント分析手術手順が完了した後、20分の最小のための寝具のない、きれいなケージに回復のための加熱パッド上でマウスを維持します。麻酔から覚ますために4分 – マウスは、通常、2を取ります。 それは完全に麻酔から回復するまで他の動物との共同居住に手術を受けた動物を返さないでください。動物は胸骨横臥位で自分自身を維持する能力を回復するまで、それは意識を取り戻している間に無人の動物を離れて監視しないでください。 疼痛管理のために最大72時間毎に6-12時間後に手術を、0.1ミリグラム/キログラムブプレノルフィン – マウスに0.05を与えます。 彼らは治癒中に無傷のまま確実にするために毎日の縫合糸を確認してください。縫合糸がほどけてくる場合には、残りの縫合糸を取り外し、交換し、麻酔下にマウスを置きます。感染またはinflammの場合ationが獣医スタッフに相談してください。 注：感染または炎症は、このプロトコルに遭遇していません。 転移研究のために、転移性疾患の外向きの兆候を含めて観察されたが、これらに限定されないまで、毎日の健康チェックを実行：> 10％の重量損失/利得、だらしなさ、周囲への注意の喪失、腹部浮腫/腹水、淡い目と耳、または猫背の姿勢。 注：転移のタイムラインが十分に理解されるまで、新たな細胞株または細胞濃度で使用するためのモデルを開発する際デイリーヘルスチェックは特に重要です。 研究のエンドポイントで、頸椎脱臼に続いてCO 2吸入によりマウスを安楽死させます。 注：研究者」監督委員会によって承認された安楽死の別の方法は、麻酔下にある間、1×PBSで灌流を含め、使用することができます。肝臓の灌流は、門脈をカニューレ挿入下大静脈をつむ、および1×PBS番目を押すことによって行われます循環血液と白血球を除去するために2分 – 1分間4ミリリットル/の速度でラフな肝血管系。 注：研究では、細胞株、および使用される濃度のエンドポイントに応じて、顕性肝転移がまたは剖検で明らかであってもなくてもよいです。微小転移病変は、肝臓の組織学的分析で明らかにすることができます。エンドポイントは、研究デザインによって異なります。 最初の胆嚢を除去することにより、ハサミやピンセットで肝臓を抽出し、その後肝臓に優れた下大静脈を切断。大静脈、門脈、および肝臓に劣る肝動脈を切断。 優しく肝臓全体を削除し、1×PBSで5回洗浄します。 左、右、中央値、および尾状葉に肝臓を分離します。 48時間、10％中性緩衝ホルマリン中にホルマリン固定肝室温で振とうしながら。プロセスが集中し、キシレンを増加させるのにアルコールの一連の組織します。パラフィンは、固定された組織71を埋め込みます</s>アップ。 注：別の方法として、肝臓は最適切断温度（OCT）式とcryomoldに組織を配置し、95％エタノール中に沈め、ドライアイスペレットに凍結することによって急速冷凍することができます。 ミクロトームを使用して、組織のマッチヘッドサイズが明らかにされるように、パラフィン包埋組織ブロックにカット。 5 4ミクロンの連続切片をカットし、これは、分析のための最初のレベルを構成しています。 組織の250ミクロンを切って、廃棄物中のこれらのセクションを投げます。 250ミクロンで、5 4ミクロンの連続切片の第二のレベルをカット。 肝臓全体を通してセクションに、必要に応じて繰り返します。ヘマトキシリンおよびエオシン染色あらゆるレベルの最初のセクションでは、転移72のために評価しました。 注：スナップ凍結組織についてのセクションをカットするクライオスタットを使用しています。 注：微小転移疾患の検出は、腫瘍細胞特異的染色が必要になります。 切開シットでの腫瘍の成長がある場合、調査からマウスを削除しますE、これは注射後腹膜腔への腫瘍細胞の漏出を示しました。 注：この問題は観察されませんでした。