JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Published: December 26, 2016
doi:
10.3791/54903
, ,
1Department of Cell, Developmental and Cancer Biology,Oregon Health and Science University

Summary

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Abstract

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה מסרטן בנשים ברחבי העולם. גרורות בכבד מעורב למעלה מ 30% מהמקרים עם גרורות סרטן השד, וכתוצאה מכך תוצאות העניים עם שיעורי ההישרדות החציוני של רק 4.8 – 15 חודשים. במודלים של מכרסמים הנוכחיים של גרורות סרטן השד, כולל xenograft תא גידול הראשוני ומודלי גידול ספונטניים, לעתים רחוקות גרורים בכבד. Intracardiac ומודלים הזרקת intrasplenic אל לגרום גרורות בכבד, אולם ניתן מבולבל מודלים אלה על ידי גרורות המשני באתר במקביל, או על ידי חסינות נפגעת כתוצאה הסרת הטחול להימנע צמיחת גידולים באזור הזריקה. כדי לענות על הצורך של מודלים גרורים בכבד השתפרו, שיטת הזרקת murine פורטל וריד המספקת תאים סרטניים ראשית וישירות אל כבד פותחתה. מודל זה מספק תאים סרטניים בכבד ללא סיבוכים של גרורות בו-זמניות באיברים אחרים או הסרה של הטחול. ההצטרפותפרוטוקול פורטל וריד imized מעסיק כרכי הזרקה קטנים של 5 – 10 μl, ≥ 32 מחטי מד, ו גזה עוצר דמום באזור הזריקה לשלוט על אובדן דם. גישת ההזרקה לוריד פורטל Balb / c עכברות באמצעות שלוש שורות גידול חלב syngeneic משתנה פוטנציאל גרורתי נבדק; תאי 4T1 גבוהים גרורתי, מתון-גרורתי תאי D2A1, ותאי D2.OR נמוכים גרורתי. ריכוזי ≤ 10,000 תאים / תוצאות ההזרקה חביון של ~ 20 – 40 ימים לפיתוח של גרורות בכבד עם קווי גרורתי 4T1 ו D2A1 גבוה, ו> 55 ימים עבור הקו D2.OR פחות אגרסיבי. מודל זה מייצג כלי חשוב ללמוד גרורות סרטן השד אל הכבד, ועשויים לחול על סוגי סרטן אחרים כי גרורות לעיתים קרובות אל הכבד כולל המעי הגס וסרטן הלבלב אדנוקרצינומה.

Introduction

סרטן שד גרור אל הכבד

הכבד הוא אתר משותף של גרורות סרטן השד, יחד עם עצם וריאות 1-3. גרורה בכבד בחולי סרטן השד הוא גורם פרוגנוסטי בלתי תלוי לתוצאות עניות מאוד 4,5, כמו חציון הישרדות של חולות סרטן השד עם גרורות טווחי כבד מפני 4.8 עד 15 חודשים 6-9. לעומת זאת, חולות סרטן שד עם ריאות או גרורות בעצמות בעלי סיכויי הישרדות חציוני של 9 עד 27.4 חודשים 8,9 ו 16.3 כדי 56 חודשים 8,10-12, בהתאמה. גרורה היא תהליך רב שלבים, המכונה מפל גרורתי, אשר מתחיל עם הפצת תאים סרטניים ב הגידול הראשוני ונגמר תמותה חולה בשל זריעת התולדה של מחזורי גידול תאים בתוך איבר רחוק 13-15. במודלים של מכרסמים של גרורות חשפו כי המפל גרורתי הוא יעיל להפליא, עם אך ורק 0.02 – 10%תאים סרטניים במחזור הקמת גרורות גלויות 16,17. אחת צוואר בקבוק עיקרי של יעילות גרורתי מוכתב על ידי microenvironments הרקמה הייחודי אתרים משניים, בשם נישות גרורתי 18, המדגיש את החשיבות של גרורות אתר ספציפי הבנה. הנישה גרורתי הוא ייחודי באתר להישנות, והוא, בין היתר, המאופיינת בתצהיר של חלבונים תאי מטריקס ברורים 19,20, חדירה של אוכלוסיות תאים חיסוניים שונים 21-23, הומאוסטזיס רקמות שינו כולל ייצור dysregulated של ציטוקינים רבים, כמוקינים, ואת גורמי גדילה 15,18,24,25. לכן, הבנה של הנישה גרורתי הרקמות הספציפית מקדימה הבנה של איך למקד מחלה גרורתית. עם זאת, מודלים חזקים של גרורות בכבד חסרים. יתר על כן, מודלים משופרים של גרורות בכבד יהיו חיוניים לזיהוי מטרות רומן וטיפולים יעילים עבור wi חולות סרטן השדגרורות בכבד ה.

הוקם מודלים לחקר סרטן שד גרור אל הכבד

כיום דגמים זמינים ללמוד הופעת גרורות סרטן השד אל הכבד כולל xenografts תאים סרטניים האנושי בעכברים נפגעים חיסוניים. מודלים אלה משתמשים בדרך כלל שורות תאי סרטן שד אנושיים-למד היטב כגון MCF-7 ו מד"א- MB-231 ו עירום, Rag1 – / -, או המארחים murine נפגעת SCID החיסונית 26-29. מודלי xenograft לספק את היתרון של מעורבי שורות תאים אנושיים שמקורם הסרטן, עם זאת, בהתחשב הייסוף האחרון עבור תאים חיסוניים גרור 30-32 ובהתנגדות טיפולית 33-35, בחקר גרורות שורה מוסמכת חיסונית מלא הוא בעל חשיבות עליון. מודלים ללמוד גרורות סרטן שד בכבד מארחים מוסמכים חיסוניים כוללים הזרקת orthotopic של תאים סרטניים syngeneic (למשל, 4T1 שורות תאי D2A1) לתוך כרית שומן החלב, עם או בלי כירורגיתכריתה של הגידול הראשוני, והערכה הבאה של גרורות 36-38. מן ראוי לציין כי שיעור גרורות בכבד ממודלי השתלת orthotopic הוא נמוך מאוד או לא קיים בהשוואה לאתרים גרורתי אחרים כגון ריאות 39,40, או מתרחש לאחר גרורות ריאות היא הוקמו, שמסבך בחקר הגרור בכבד ספציפי 37,39 .

explants הגידול ממודלים סרטן השד ספונטנית מהונדסים גנטית ניתן מחדש מוזרק לתוך רפידות שומן החלב של המארחים תמימים תאים סרטניים syngeneic. לדוגמא, נמסר לאחרונה כי גידולים ספונטניים מעכברי K14 Cre ECad f / f P53 f / f, איזה דגם פולשני סרטן השד לובולרי, לפתח גידולים כאשר הוא מוזרק orthotopically לתוך מארחי wildtype. בעקבות כריתה כירורגית של גידולים אלה ברגע שהם מגיעים 15 מ"מ 2, 18% מהעכברים התקדמו כבד גרור 40,41. גישה שלישית מודל שימושים גרורות בכבדגרורות ספונטניות בעכברים מהונדסים גנטי. עד כה, דיווחים של מודלים בעכברים ספונטניים של גרורות סרטן שד שהתפשטו בקלות אל הכבד אינם שכיחים. יוצאים מן הכלל הן H19-IGF2, את p53 FP / FP MMTV-Cre Wap-Cre, ואת P53 K14 Cre ECad f / f f / f במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, שבו גרורות בכבד מפתחת אצל אחוז נמוך של עכברים 38,41- 43. וכך, בעוד מודלי עכברים מהונדסים גנטי להקל על המחקר של כל השלבים של המפל גרורתי, מתן מודלי עצמה רלוונטיים קליני, הם מוגבלים בשל שיעורים נמוכים של גרורות בכבד 38.

מודלים גרורים כמה לעקוף את השלבים הראשוניים של מפל גרורתי לרבות הפצת תאים סרטניים מהגידול הראשוני ו intravasation. מודלים אלה מאפשרים חקירת השלבים המאוחרים של המפל גרורתי, מן extravasation להקמת גידולים באתרים משניים. intמודל הזרקת racardiac מספק תאים סרטניים לתוך החדר השמאלי, אשר מפיץ תאים סרטניים לתוך מערכת הדם באמצעות האאורטה. הזרקת intracardiac דורש הדמיה אולטרסאונד מונחה של הזריקה או שיטות הדמיה אחרות כגון פליטת אור בלוציפראז מתויג תאים כדי לאשר זריקה מוצלחת. הזרקת תאים סרטנית באמצעות החדר השמאלי עלולה לגרום עצם, מוח, ריאות, ו / או גרורה בכבד, בקרב גופים אחרים 44-48. בגלל גרורות רבות-איבר, עכברים אלה זקוקים לעתים קרובות כדי להיות מורדמים לפני ההתפתחות גרורה בכבד גלוי, שלילת היכולת לחקור צמיחת גרורתי מלאה בתוך הכבד. גישה חלופית באופן משמעותי מצמצמת את ההתפתחות גרורה רב באתר היא מודל הזרקת intrasplenic. הזרקת Intrasplenic מספק תאים סרטניים דרך וריד הטחול המתחבר עם וריד מצע המעי העליון להפוך את וריד שער 49,50. ניתן לנטר בעלי חיים עבור outgrowth של גרורות בכבד בגלל היווצרות של גרורות באתרים אחרים היא נדירה, וכתוצאה מכך, את הבריאות הכללית של החיה נשמרת 49,50. עם זאת, חשוב לציין כי המודל intrasplenic דורש כריתת טחול להימנע גידולים הטחול 49,50, הליך אשר משפיע תפקוד מערכת החיסון. לדוגמא, פגיעת reperfusion איסכמיה לבבית מאופיינת חדיר תת מונוציטים Ly6C + שמקורן הטחול אחראי phagocytic ופעילות פרוטאוליטים במהלך ריפוי הפצע הבא איסכמיה 51,52. עם כריתת טחול, קיימת ירידה שנצפתה אוכלוסיות מונוציטים המסייעים איחוי פצעים 52. יתר על כן, כריתת טחול הוכח להפחית את צמיחת הגידול הראשוני וגרורות ריאות במודל סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים, במיוחד באמצעות צמצום מספר מחזורי התוך הגידול CCR2 + CD11b + Ly6C + myelo monocyticid תאים 53. בנוסף, כריתת טחול לאחר ההזרקה intrasplenic של תאי סרטן המעי הגס הביא רמות נמוכות של תאי הרג טבעיים אנטי סרטניים בבלוטות הלימפה mesenteric ו -54 גרורות בכבד גבוהות. לסיכום, ממצאים אלה מראים כי כריתת טחול פוגעת התפקיד של מערכת החיסון עם השלכות מאוחרות גורל תא גרורתי.

פורטל וריד דגם הזרקה של כבד גרור

כדי לחקור גרורות סרטן שד בכבד שורה מוסמכת חיסונית באופן מלא, בתנאי שבה עכברים אינם נמצאים בסיכון עקב גרורות רבות-איבר, מודל הזרקה לוריד פורטל פותחתה. מודלי הזרקת Intraportal שמשו בעבר כדי ללמוד גרורות בכבד של שורות תאי המעי גס 55,56 ומלנומה 16; כאן אנו מתארים יישום של זריקת intraportal מודל גרורות תאים סרטניים חלב syngeneic. ניתן להשתמש במודל זה כדי ללמודבשלבים מאוחרים יותר של מפל גרורתי כולל extravasation תאי סרטן השד וזריעה, החלטות גורל תאים סרטניים לגבי מוות / התפשטות / תרדמת, ואת תולדה לתוך נגעים גלוי. במודל זה, שורות תאים סרטניים חלב syngeneic מוזרקות דרך וריד הפורטל של עכברות חיסוניות מוסמכות Balb / c, שיטה המספק תאים סרטניים ראשית וישירות אל הכבד ללא הסרת הטחול. כדי לפתח מודל זה, השימוש של שורות תאים סרטניים ארבעה החלב כי טווח יכולת גרורתי שלהם מהנמוך לגבוה הועסקו: D2.OR, D2A1, ו 4T1, ו מועסקים D2A1 מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (D2A1-GFP) כדי לחקור מוקדם בזמן נקודות לאחר הזרקת תאים סרטניים. 4T1 היא שורת תאים גרורתי מאוד נגזר הגידול 410.4 שהתעוררו ספונטני עכבר MMTV + Balb / c נקבה 36,37 גרורות אל הריאות, הכבד, המוח, ואת עצם גידולים ראשוניים כרית שומן החלב 39,57,58. D2A1 תאים סרטניים werהדואר גם במקור נגזר גידול חלב ספונטני לארח Balb / c לאחר ההשתלה של תאי גולת המכתשית hyperplastic D2, והם אשרו להיות גרורתי מן הגידול הראשוני אל הריאות 59,60. D2.OR תאים סרטניים הם קו אחותו הלא-גרורתי לקו D2A1, ואף שהם לברוח הגידול הראשוני ומגיעים אתרים משניים, שהם כמעט ולא להקים גרורות מרוחקות 60,61.

בנוסף, חשוב להימנע שימוש בתרופות לטיפול בכאב מועסק בדרך כלל כולל תרופות סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) במהלך או לאחר ההליך הכירורגי. יש NSAIDs פעילות אנטי גידולית בסרטן השד מסוימים 62-65, וכמה סוגים של NSAIDs מעלה את הסיכון לרעילות כבדית 66,67, פוטנציאל להתפשר בחקר גרורות בכבד ואת נישה גרורתי בכבד. יתר על כן, מחקרים מראים כי NSAIDs משפיע ישירות על המיקרו-סביבת הרקמות, הפחתת שלוחה פרו-גרורתיחלבונים מטריצה racellular tenascin-C 68 ו קולגן סיבי 62,65. לחלופין, את השימוש של נגזר אופיואידים, עצירות, שימש בגלל יעילותו בניהול מכרסם כאב 69 ובשל חוסר ראיות שיש אופיואידים פעילות אנטי גידולית 70. מודל הזרקת פורטל וריד זו הוטב כרכי הזרקה קטנים של 5 – 10 μl כדי למנוע ניזק מיותר אל הכבד. המודל היה מותאם גם לכלול מחטים עם קוטר קטן יותר (≥ 32 מד) ושימוש גזה עוצר דמום מיד לאחר ההזרקה כדי להקטין את איבוד הדם במהלך ההליך. בניגוד פרמטרי הזרקה המותאם אלה, מספרים סלולריים צריכים להיקבע על בסיס פרטני, מבוססים על פוטנציאל tumorigenic של הקו הסלולרי. עם זאת, החל מ ≤ 10,000 תאים / הזרקה עבור מחקרים ארוך טווח מומלץ. עבור נקודות קצה קצרות (למשל, 24 שעות לאחר הזרקה) הרבה יותר תאים סרטניים (למשל,1 x 10 5 – 1 x 10 6) ניתן להשתמש אם מוצדק. לסיכום, מודל ההזרקה לוריד פורטל המפורט כאן מהווה כלי שימושי לחקר גרורות סרטן השד בכבד עוקף מספר המגבלות של מודלים גרורים בכבד אחרים. מודל זה הופך לפשוט מחקר של extravasation תאים סרטניים, זריעה, החלטות גורל מוקדמות של הישרדות, התפשטות, תרדמת, ואת תולדה גרורתית מארחי murine מוסמכות חיסוניים.

Protocol

הנהלים כל חיה במאמר זה היו נבדקה ואושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע ועדת שימוש. 1. הכנה של אזור מכשירי הניתוח הכן את המספריים, מלקחיים, hemostat על ידי אידוי ב 124 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 1 – 2 ימים לפני הניתוחים המתוכננים. ודא גישת מצעי autoclaved או סטרילי, כלובים ומזון לבעלי התאוששות לאחר ניתוח. כן אזור ניתוח מזוהם, רצוי במנדף זרימה למינרית. נגבו את כל המשטחים של אזור הניתוח עם 10% אקונומיקה, כולל כרית חימום, מקור האור, צינורות הרדמה חרטומו, וכל חלק אחר של לחדרי הניתוח כי יהיה בסמיכות ההליך הכירורגי בזמן שהוא ביצע . בתחום כירורגית ספטית, למקם את כרית החימום לנקות עם וילון סטרילית, מקור אור, צינורות הרדמה nosecone, מזרקי אינסולין, 1 מ"ל מזרקים, bupivacaine, דמעות מלאכותיות, מלח סטרילית, 2 x 2 "ספוגים גזה סטרילי, 4 x 4" גזה סטרילי, לחתוך גזה עוצר דמום לתוך 0.5 – 1 ס"מ 2 חתיכות, מספריים, מלקחיים, hemostat, 4-0 תפרים vicryl עם להתחדד מחט, גלוקונאט כלורהקסידין 50 מ"ל 2% במיכל autoclaved. ודא כי יש מקום במרחב הזה עבור תאים סרטניים מוכנים מאוחסנים על קרח. על הספסל הסמוך לאזור כירורגית, להכין את אזור ההתאוששות עם כרית חימום שנייה וכלובים נקיים עם מצעים סטרילי. הערה: אזור זה יכול גם פריטים לבית כגון מעקר חרוז. 2. הזרקת Portal Vein One-שעה לפני הזריקות המתוכננות, לטפל Balb / c עכברות בן 8 – 15 שבועות עם 100 μl של 0.015 מ"ג / מיליליטר עצירות, תת עורי, לניהול כאב. הערה: פרוטוקול הזרקה זה עשוי להיות מיושם על כל זן של עכבר נקבה או זכר בכל גיל, באמצעות מתאיםשורות תאים לשינויים לזן. כן התאים הסרטניים להזרקה המבוסס על פרוטוקולים עבור הקו הסלולרי או explant גידול של בחירה. בחן את כל שורות תאים סרטניים לפני מתן לנוכחות של פתוגנים בעכברים כדי להפחית את הסיכון של החדרת פתוגנים כאלה לתוך המושבה החי. לקבלת syngeneic Balb / c שורות תאים סרטניים כולל D2A1, D2.OR, ותאים סרטניים 4T1, תאים ההפשרה לתוך צלחת תרבות 10 ס"מ רקמות 3 ימים לפני הזריקה כך התאים למחרת נמצאים ~ 90 – 100% confluency. 1 יום תאים סרטניים בעקבות הפשרה לשטוף תאי פעם עם בופר פוספט 1x (PBS) ו trypsinize התאים הסרטניים ומחובר באמצעות 2 מיליליטר של טריפסין 0.05% ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף 8 מיליליטר של מדיה מלאה (גלוקוז DMEM הגבוה, 10% בסרום שור עוברי, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין) ומעבר 01:10 לתוך צלחת מתוקה 10 סנטימטרים עם 10 מיליליטר של מדיה מלאה. ביום של זריקות, לשטוף תאים פעם עם PBS 1x ו trypsinize כמתואר לעיל. Resuspend תאים trypsinized ב 8 מ"ל של מדיה מלאה, ספין במשך 5 דקות ב 1500 XG, להסיר את המדיה ו resuspend ב 5 מ"ל 1x PBS. ספירת תאים על hemocytometer באמצעות הרחקת trypan הכחולה להערכה כדאית. Resuspend תאים להזרקה 1x PBS בריכוז ונפח שנקבע מראש. הערה: 5 – 10 μl מומלצים כמו כרכי הזרקה קטנים למנוע ניזק מיותר אל הכבד. שמור את התאים על קרח למשך של זריקות. בעקבות השלמת זריקות, לחזור דגימת תאים למעבדה ומקום בתרבות במדיה המלא ל 1 יום כדי להבטיח את יכולת הקיום. מניחים את העכבר תחת הרדמה עם 2 – 2.5 isoflurane% (2-כלורו-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-אתאן) נמסר חמצן. לשמור על טמפרטורת הגוף באמצעות כרית חימום. ודא הרדמה מלאה על ידי הערכה לתגובת קמצוץ בוהן, ולאחר מכן לשמור anestheSIA ב 2 – 2.5% isoflurane. הערה: חשוב לעקוב אחר בעלי החיים קצב הנשימה ולהתאים את בספיקה isoflurane בהתאם לאורך כל ההליך. מניחים כמות קטנה של דמעות מלאכותיות או משחה הווטרינר מעל כל עין כדי למנוע ייבוש יתר של העיניים במהלך ההליך הכירורגי. מניחים את העכבר במצב שכיבה, על גבו עם הבטן חשוף. הסרת שיער בצד שמאל הגחון של המכרסם ממרחב הצלע השני למטה אל הפטמה בלוטת חלב מפשעתי 4 th על ידי מנגב את האזור עם מקריח כימי. אפשר מקריח לשבת 1 – 2 דקות ולאחר מכן להסיר לחלוטין עם גזה ו- H 2 O. שלב זה יכול להיעשות 1 – 2 ימים מראש כדי לחסוך זמן אם ניתוחים רבים מתוכננים. קח אחד 2 x 2 "ספוג גזה סטרילי (שהושרו 2% כלורהקסידין) ולנגב את העכבר באתר של הסרת שיער. לחטא את האזור שמסביב, כולל הזנב, כדי למזער המשך חיידקיamination של מכשירים. נגב את האתר של הסרת שיער וסביבתה למטה עם כרית הכנת אלכוהול. חזור על 2% כלורהקסידין וצעדי אלכוהול פעם יותר ולסיים עם כלורהקסידין סופי לנגב עבור סכום כולל של שלושה כלורהקסידין 2% והשני שוטף כרית הכנת אלכוהול. האם כלורהקסידין הסופי לנגב כך הכימי אינו מטפטף סביב האתר כירורגית כדי למנוע כלורהקסידין מקבל על איברים פנימיים. הערה: יישום של כמויות גדולות של כלורהקסידין ואלכוהול לעור ופרווה סביב עלול לגרום לירידה משמעותית בטמפרטורת הגוף. אין לנגב עם נפח עודף במהלך השלבים 2.7-2.9. לשמור על טמפרטורת גוף עם כרית חימום. שימוש בכפפות סטריליות ו אזמל מעוקר עם להב סטרילי, לעשות חתך 1 אינץ יחיד לתוך העור בין מטוסי חציון sagittal בצד השמאלי של העכבר, החל ממש מתחת לצלעות וכלה בדיוק מעל למישור של מפשעתי הרביעית פטמת בלוטת חלב. בעזרת מספריים autoclaved או חרוז מעוקרים מלקחיים, לעשות חתך 1 אינץ דומה לתוך הצפק. הימנע חיתוך לתוך כרית שומן החלב ולהבטיח שלא לחתוך את המעיים, הכבד, או הסרעפת. הניחו כרית גזה "4 x 4 ספוגה תמיסת מלח סטרילית בצד השמאלי של העכבר, שבו החתך נעשה, כך האיברים הפנימיים ניתן למקם על גזה ולא באים במגע עם העור שמסביב או אזור הניתוח. כן תאים סרטניים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים כמו תאים סרטניים יישבו במהלך תקופת ההכנה של העכבר. הכן מזרק מחט נשלף 25 μl ומחט 32 מד עם תאים סרטניים. לדחוף את הבוכנה עד תאים סרטניים נמצאים קצה המחט ואת הבוכנה היא בווליום המתאים להזרקה; למנוע הזרקת בועות אוויר. נגב את החלק החיצוני של המחט עם כרית אלכוהול סטרילי כדי להסיר כל תאים סרטניים חיצוניים. היזהר כדי למנוע מקלות מחט. החזק את sid החציונידואר של החתך, כולל עור והצפק, הצידה עם מלקחיים ולהשתמש מקלון צמר גפן סטרילי כדי למשוך את המעי הגס בזהירות קטן החוצה, הצבתם על גזה סטרילי טבול תמיסת מלח סטרילית. משוך את מעי גס והקטן עד וריד השער הוא מדמיין. מכסים את האיברים הפנימיים של גזה ספוג מלח כדי לשמור על לחות פנימית ועקרות. יש עוזר, גם לובשים כפפות סטריליות, להחזיק את המעיים עטופים הגזה המלוחה ספוג בעדינות מהדרך עם צמר גפן סטרילי הטה ספוגית כדי לחשוף את וריד השער מלא. בנוסף, ייתכן שיהיה צורך להשתמש hemostat autoclaved או מלקחיים להחזיק רקמות הצידה בצד החציוני של החתך. הכנס את המחט טעון עם תאים סרטניים ~ 3 – 5 מ"מ לתוך וריד שער ~ 10 מ"מ מתחת הכבד בזווית <5 ° אל הווריד, עם שיפוע כלפי מעלה. לאט לאט להזריק את הווליום המכיל תאים סרטניים. מאפשר לדם לזרום בעבר המחט hEAD במשך כמה שניות כדי למנוע חזרה זרימת תאים סרטניים מתוך הווריד. מזער הזזת המחט בווריד במהלך ההזרקה. שוב, לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע מקלות מחט. הערה: ויזואליזציה של וריד השער נעשתה ללא גדלה, אולם מיקרוסקופ סטריאו עשוי לשמש אם מועדף. הסר את המחט תוך שימת זמנית המוליך טיפ גפן סטרילי על הווריד עם הלחץ. עם עוזר עדיין מחזיק את המעיים בצד למקם חתיכה אחת של 0.5 – גזה עוצר דמום 1 ס"מ 2 על הזריקה על הווריד. הערה: אבקת עוצר דמום נוסתה גם על שלב זה בפרוטוקול אבל לא היה יעיל בעצירת איבוד דם ורידי לאחר ההזרקה. החזק את הגזה עוצרת דמום במקום ההזרקה עם לחץ מצד המוליך טיפ גפן סטרילי במשך 5 דקות. להעריך סגירת וריד על ידי הרמת גזה עוצר דמום בזהירות, אם מקלות גזה אל הרקמה שמסביב, כמות קטנה של sterilמלוח דואר יכול לשמש כדי להשרות הרים את התחבושת. אם איבוד הדם מתרחש בשלב זה, למקם פיסה נוספת של גזה עוצרת דמום באתר עם הלחצים 5 דקות נוספות. כאשר זרימת הדם חדל לגמרי, להסיר את התחבושת מעל העכבר. הערה: איבוד דם במהלך ההליך הכירורגי צריך להיבדק בקפידה אם נפח איבוד דם מותר הכולל נפגש או חריגה (מבוסס על נהלי עבודה סטנדרטיים רגולטורי לעניין לוחות הסקירה המוסדיים של החוקר) העכבר חייב להיות מורדם לאחר הרדמה ידי זלוף לב. לאחר הזריקה נחשבת ללא פגע, ללא דם עוזב את הזריקה, למקם את האיברים הפנימיים בעדינות בחזרה לתוך חלל הבטן. לתפור את והצפק ולאחר מכן את העור עם מחט 4-0 vicryl תפר וחידוד סטרילי באמצעות דפוס תפר מתמשך או קטע פשוט. בדרך כלל, סגירת החתך דורשת 10-15 תפרים. להזריק 100 μl של bupivacaine (5 מ"ג / מ"ל) לאורך באתר חתך לניהול כאב מקומי באמצעות מזרק אינסולין. להזריק 0.5 מ"ל של תת-עורית מלח סטרילית באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד לחות. ניתוחים לקחת 15 – 25 דקות כדי להשלים. כדי לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל הניתוח, להבטיח כי כל הכלים והחומרים הבאים במגע עם העכבר, כולל בידיים עטויות כפפות, מנקים לפני כראוי לפנות. איפה שימוש אפשרי חומרים וכפפות סטריליות, או מינימלית לנצל פתרון אתנול 70% או 10% פתרון אקונומיקה לניקוי. אם מספר ניתוחים מתוכננים בפגישה אחת לסדר את אזור הניתוח הראשוני עם וילון סטרילי טרי, מזרקים אינסולין, 1 מ"ל מזרקים, מלח סטרילית, 2 x 2 "ספוגים גזה סטרילי, 4 x 4" גזה סטרילי, גזה עוצר דמום וחותכים 0.5 – 1 ס"מ 2 חתיכות, 4-0 תפרים vicryl עם מחט להתחדד, ו -2% כלורהקסידין. חרוזים לעקר את המספריים, מלקחיים, hemostat בין ניתוחים ולאפשרלהתקרר לפני שימוש חוזר כראוי. שחזור 3., ניטור בריאות מכרסמת, ו ניתוח נקודות קצה לאחר ההליך הכירורגי הושלמה, לשמור על עכברים על כרית חימום להתאוששות בכלובים מצעים ללא, נקי למשך תקופה מינימלית של 20 דקות. עכברים בדרך כלל לוקחים 2 – 4 דקות להתעורר מן ההרדמה. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לשתף למגורים עם בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. אל תשאירו חיה ללא השגחה בזמן שהוא שב להכרתו ולפקח עד שהחיה יש חזר היכולת לקיים את עצמה שכיבה sternal. תן עכברים 0.05 – 0.1 מ"ג / ק"ג עצירות לניהול כאב בכל ניתוח 6-12 שעות הבאים, לתקופה של עד 72 שעות. בדקו תפרים יומיים כדי להבטיח שהם יישארו ללא פגע במהלך ריפוי. במקרה כי תפרים נפרמו, הצב את העכבר בהרדמה, להסיר תפרים נותרים, ולהחליף. במקרה של זיהום או inflammation להתייעץ צוות וטרינר. הערה: זיהום או דלקת לא נחשף אליהן עם פרוטוקול זה. עבור מחקרים גרורים, לבצע בדיקות תקינות מדי יום עד שעת סימנים חיצוניים של מחלה גרורתית הם נצפו כולל, אך לא רק:> 10% ירידה במשקל / רווח, scruffiness, אובדן תשומת הלב לסביבה, בצקת בטן / מיימת, עיניו בהירות ואוזניים, או עמדה שפופה. הערה: בדיקות תקינות יומיות חשובות במיוחד בעת פיתוח המודל לשימוש עם קו סלולארי חדש או ריכוז תא עד הציר הזמן של גרורות מובנות היטב. בסוף נקודות מחקר, להרדים עכברים משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. הערה: שיטות חלופיות של המתת חסד אושרה על ידי ועדת הביקורת של החוקרים עשויים לשמש, כולל זלוף עם 1x PBS לאחר הרדמה. זלוף של הכבד מתבצע על ידי cannulating וריד השער, לגזום את הווריד הנבוב הנח, ודוחף ה 1x PBSכלי הדם בכבד מחוספס בשיעור של 4 מ"ל / דקה 1 – 2 דקות כדי להסיר במחזור הדם לויקוציטים. הערה: בהתאם הקצה לחקר, הקו הסלולרי, ואת הריכוז בשימוש, גרורה בכבד גלוי עשויים או לא עשוי להיות נראה לעין necropsy. נגעי Micrometastatic עשויים להתגלות עם ניתוח היסטולוגית של הכבד. נקודות קצה ישתנה בהתאם לצורת המחקר. חלץ את הכבד עם מספרי מלקחיים על ידי הסרת כיס המרה הראשונה, ולאחר מכן לחתוך את הווריד הנבוב הנח מעולה אל הכבד. חותך דרך הווריד הנבוב, וריד שער, ואת כבד עורק נח אל הכבד. הסר את הכבד כולו בעדינות ולשטוף 5x ב 1x PBS. הפרד את הכבד לתוך שמאלה, ימינה, חציון, ואת האונות caudate. הכבד לתקן פורמלין ב 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין למשך 48 שעות תוך רעד בטמפרטורת החדר. תהליך רקמות באמצעות סדרה של כהלים לגידול בריכוזיות קסילן; פרפין להטביע את הרקמה הקבועה 71 </sעד>. הערה: לחילופין, הכבד ניתן snap-קפוא על ידי הצבת רקמה cryomold עם חיתוך הטמפרטורה האופטימלית (OCT) הנוסחה והקפאת על כדורי קרח יבש שקוע 95% אתנול. באמצעות microtome, וחותכים את גוש רקמות מוטבע פרפין כך גודל של רקמות התאמה ראש מתגלה. חותך חמישה 4 מיקרון קטעי סדרתי, זה מהווה את הרמה הראשונה לניתוח. חותכים דרך 250 מיקרון של רקמות, לזרוק סעיפים אלה בתוך הפסולת. ממרחק של 250 מיקרון לחתוך רמה שנייה של חמישה קטעים סדרו 4 מיקרון. חזור על הצורך לסעיף דרך הכבד כולו. Hematoxylin ו כתם eosin את החלק הראשון של כל רמה כדי להעריך גרורות 72. הערה: לקבלת רקמות Snap-קפוא להשתמש cryostat לחתוך חלקים. הערה: איתור של המחלה micrometastatic ידרוש תאים סרטניים מכתים ספציפיים. הסר עכברים ממחקר אם יש צמיחת הגידול ב החתך לשבתדואר, כמו זה מציין זליגת תאים סרטניים לתוך חלל הצפק לאחר ההזרקה. הערה: בעיה זו לא נצפתה.

Representative Results

מודל ההזרקה לוריד פורטל, שבו תאים סרטניים מועברים ישירות אל הכבד באמצעות הליך כירורגי, מאפשר הזרקה של תאי גידול לתוך וריד השער. בתנאי חיטוי, ב עכבר הרדים, מצוין ~ חתך ניתוחי 1 אינץ נעשה בצד השמאלי של העכבר בין המטוסים החציוני ועל sagittal, החל רק מעל למישור של הפטמה בלוטת חלב מפשעתי הרביעית וכלה בדיוק מתחת לצלעות . המעיים גדולים וקטנים הם משכו בעדינות דרך חתך לספק הדמיה של וריד השער (איור 1 א). זיהוי אנטומי מדויק של וריד פורטל הזרקה תוך-פורטל מוצלח יכול להיות מאושר על ידי תרגול פרוטוקול הזרקת בדיו או צבע דומה. הזרקת נכון דרך וריד הפורטל תגרום הדיו מועבר מיד ובאופן ספציפי אל הכבד, ולא לגרום התפשטות דיו הודו אל הריאות (figuמחדש 1B). יתר על כן, באמצעות העכבר D2A1 תאים החלב הגידול מתויג עם GFP, פיזור של תאים סרטניים בתוך הכבד ניכר בגיל תשעים דקות לאחר ההזרקה, המאשר משלוח הזרקה לווריד פורטל אל הכבד (תרשים 1C). בהגדלה גבוהה יותר מתברר כי ב 90 דקות לאחר ההזרקה, תאים סרטניים נמצאים בתוך sinusoids, כמו גם בתוך parenchyma הכבד בסמיכות השלשות פורטל, שם הדם פורטל וריד נכנס הכבד (תרשים 1C). נתונים אלה מראים כי extravasation גידול התא הפעיל מתרחש ב 90 דקות הזרקת תא שלאחר הגידול. יחדיו, נתונים אלה מאשרים כי מודל ההזרקה לוריד פורטל מספק את עוצמת הזריקה ישירות אל הכבד, עם תאי דיו או גידול פזור הכבדה אין תחבורה ניכרת של נפח הזרקה אל הריאות. כדי להעריך חוסנו של המודל הזרקה לווריד פורטל, שלושה separאכול שורות תאים סרטניים חלב עכבר syngeneic נבדקו בעכברי Balb / c נקבה בוגרת. קווי גידול חלב אלה נבחרו על סמך ההתנהגות המאופיינת שלהם במודלי כרית שומן חלב וכוללים את קו 4T1 תאים אגרסיווי גרורתי מאוד, קו D2A1 גרורתי פחות אגרסיווי, וקו D2.OR הנמוך / לא גרורתי 37,61,73 , 74. 2,000 ו -10,000 תאים לכל הזרקה נבדקו ללא הבדלים בולטים בזמן להתפתחות גרורה גלוי עם ריכוזי תא הנמוכים אלה. עבור מחקרים אלה סמנים פונדקאיים של גרורות שמשו כגון חוסר טיפוח, חיוורון, וירידה במשקל כדי להצדיק necropsy, שעליו קיומו או אי קיומו של גרורות בכבד אושר על ידי הערכה חזותית של הכבד ואיברים אחרים כדי לאשר משלוח תוך-פורטל . נתונים אלה מאשרים דיווחים קודמים כי שורות תאי 4T1 ו D2A1 לייצג קווי גידול חלב אגרסיביים יותר, שיעורי הישרדות ללא גרורות קצרות הם נצפו לעומת עכברים שהוזרקועם קו D2.OR פחות אגרסיבי (איור 2 א). עכברים הוזרקו תאים סרטניים 4T1 או D2A1 פיתח גרורות בכבד גלויה על ידי ~ 30 – 40 ימים לאחר ההזרקה, וכמה פיתח גרורות מוקדם ככל 18 ימים לאחר ההזרקה (איור 2 א), ואילו רק עכבר אחד הוזרקו תאים D2.OR היה גרורה בכבד גלוי מפותח עד סוף המחקר, אשר היה 60 – 65 ימי הזרקת תא שלאחר גידול. גרורות לאחר מכן אושרו על ידי חתך דרך הכבד ב 250 מיקרומטר רמות וניתוח hematoxylin ו eosin (H & E) סעיפים מוכתם (תרשים 2B-D). בנוסף לגילוי גרור גלוי בכבד העכבר, מודל וריד שער יכול גם להיות מנוצל ללימוד אירועים קודמים במפל גרורתי כולל זיהוי של תאים בודדים / צבירי תאים הבאים extravasation, היווצרות של נגעי מייקרו גרורתי. immunofluorescence מכתים Multiplex שמשכדי לזהות 4T1, D2A1, ותאי הגידול החלב D2.OR בכבד כשהם נוכחים כמו תאים בודדים או נגעים מיקרו-גרורות, כמו H & E אינה מספיקה כדי לאשר את קיומו של נגעים קטנים. 3A איור מראה Balb / c עכבר כבד נציג עם מוקדים המשוערת micrometastatic של תאי D2A1 גידול כי הם חיוביים עבור CK18 קרטין אפיתל, שליליים על CD45 סמן הפאן החיסוני, ושליליים עבור סמן hepatocyte Heppar-1. Hepatocytes גם להכתים חיובי עבור CK18, הדבר מחייב שימוש Heppar-1 בלוח מכתים זה. הערה חשובה אחת היא שתא מרת צינור אפיתל וכבד ובתאים להכתים חיובי עבור CK18, מחייב אפליה זהירה בין תאים סרטניים ודרכי מרה, במיוחד כאשר מעריכים אזורי periportal (איור 3 א). חלופה זמנית immunofluorescence לזהות תאים בודדים יופצו מוקדי micrometastatic היא לנצל קווי גידול חלב syngeneic מתויגים עם פלואורסצנטי ירוק משופרחלבון (eGFP) ו / או בלוציפראז ולבצע IHC עבור התג (תרשים 1C). בשל החיסוני של eGFP, בלוציפראז, וחלבונים אחרים, זה חיוני כדי להשתמש במודלים של עכברים אשר tolerized לחלבונים אלה, כגון עכבר "זוהר הראש" מוסמכות החיסונית רומן מבטא eGFP ו בלוציפראז בבלוטת יותרת המוח הקדמית 75. עבור זיהוי נגעים macrometastatic קווי syngeneic מתויגות כגון קו הגידול D2A1, את immunofluorescence זמנית CK18 / Heppar-1 / CD45 הוא אידיאלי (איור 3 ב). איור 1: הזרקת Portal Vein מספקת תאים סרטניים ישירות אל הכבד. א) הזרקה לווריד פורטל; החתך הוא עשה בין החציון ומטוסי sagittal שמאל, מלמעלה המטוס של הפטמה בלוטת חלב מפשעתי הרביעית וכלה ממש מתחת רי כלוב ב. B) Balb / c כבד עם הזרקת PBS (משמאל). בעקבות הזרקת דיו הודו דרך וריד הפורטל, הכבד (באמצע) אבל לא הריאה (מימין) תופס דיו. C) תמונות בסעיף נציג דקה של תאים סרטניים החלב עכבר D2A1 מתויג עם GFP בתוך הכבד עכבר Balb / c ב 90 דקות לאחר ההזרקה של 1 x 10 6 תאים סרטניים דרך וריד הפורטל. כבדי תוקנו בפורמלין, פרפין מוטבע, מחולק, ומוכתמת עם נוגדן אנטי- GFP לגילוי תאים סרטניים. פנל עליון מראה תאים סרטניים צבועים בחום כהה (חיצים) המפוזרים בתוך הכבד, כוכבית מציינת מכתים hepatocyte הלא ספציפית סביב ורידים מרכזיים; סרגל = 300 מיקרומטר. פנלים תחתונים מראים תמונות נציג של תאים סרטניים ב 90 דקות לאחר ההזרקה עדיין קשורה קשר הדוק עם כלי דם; סרגל = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> איור 2: תולדה של שורות תאים סרטניים עכבר חלב בכבד בעקבות הזרקת Portal Vein. א) עקום Kaplan-Meier מראים שיעורי הישרדות ללא-גרורות עכברים שהוזרק עם 2,000-10,000 4T1, D2A1, או תאים סרטניים חלב עכבר D2.OR. עכברים הוזרקו תאים סרטניים וכן פיקוח על סימנים של גרורות כולל חוסר הטיפוח, עיניו בהירות, שינויים במשקל. גרורה אושרה בשעת necropsy ועל ידי H & E על סעיפים היסטולוגית של הכבדים. N = 2 4T1 2,000 תאים; 2 4T1 10,000 תאים. N = 2 D2A1 2,000 תאים; 3 D2A1 10,000 תאים. N = 3 D2.OR 2,000 תאים; 3 D2.OR 10,000 תאים. נציג H & E תמונות של B) 4T1 נגעים ב 21 ימים לאחר ההזרקה של 10,000 תאים, C) נגעים D2A1 ב 26 ימים לאחר ההזרקה של 10,000 תאים סרטניים, ו- D) D2.OR נגעים ב59 ימים לאחר הזרקה של 10,000 תאים; סולם ברים = 75 מיקרומטר. נגעים דומים נצפו כאשר 2,000 4T1 או D2A1 תאים סרטניים הוזרקו. אין נגעים התגלו עם 2,000 תאים D2.OR. אין ראיות של גרורות באיברים אחרים או החתך באתר כירורגית באו לידי ביטוי בכל עכבר על מחקרים אלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: איתור של תאים בודדים גרורתי נגעים בכבד העכבר באמצעות Multiplex Immunofluorescence. א) immunofluorescence זמנית נציג של תאים סרטניים D2A1 בתוך הכבד עכבר Balb / c ב 90 דקות לאחר ההזרקה באמצעות מודל הזרקה לווריד פורטל. המכתים נעשה באמצעות ערכה זמנית. משמאל לימין תערוכות DAPI; CD45 לציון לויקוציטים; Heppar-1 עד מרץk hepatocytes; ו CK18 לסמן תאים סרטניים, hepatocytes, אפיתל צינור המרה. תמונה ממוזגת מציגה מקבץ משוער של CK18 + Heppar-1 – CD45 – התאים סרטניים D2A1 קשר הדוק עם שלישיית פורטל. חץ = תאים סרטניים D2A1, כוכבית = האפיתל מר צינור; סרגל = 25 מיקרומטר. ב) נגע גרורתי נציג הגלוי D2A1 באמצעות אותה חלונית מכתימה כמו תאים סרטניים א הם CK18 + ואילו hepatocytes סמוך CK18 + Heppar-1 +; סרגל = 25 מיקרומטר. תמונות נתפסו על מיקרוסקופ עם 20 x 0.8, 40 x 1.3, ו -60 x 1.4 מטרות מצלמת CCD, באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מודל ההזרקה לוריד פורטל עכבר Balb / c מתיר המחקר של נגעי סרטן שד בכבד בהיעדר גרורות רב-איבר מבלבלים וב שורה מוסמכת חיסונית באופן מלא. הפרוטוקול שלנו הוא קידום של הליכים כירורגיים שפורסמו בעבר המאפשרים גישת וריד השער עבור הזרקה של תאים סרטניים באופן ישיר לתוך הכבד 16,55,56. קידום אחת עשינו הוא להפחית את מספר התאים סרטניים מוזרקים באופן משמעותי מן ≥ 1 x 10 5 תאים / הזרקה 16,55,56 עד ≤ 10,000 תאים סרטניים / הזרקה. יש לנו גם הרחיב את המודל לחקר גרורות סרטן השד אל הכבד. שימוש בפרוטוקול זה, שתי שורות תאי סרטן שד עם פוטנציאל גרורתי ידוע לפתח גרורות בכבד עם חביון קצר יותר מאשר קו תאים סרטניים חלב שלו יותר. יתר על כן, בנקודות זמן מוקדמות, תאים סרטניים מופצים ברחבי parenchyma הכבד כקבוצות יחידות או קטנות של ce היחידLLS לאחר הזרקת תאים סרטניים. המודל צפוי במטרה לענות על שאלות של יעילות גרורתי כולל extravasation תאים סרטניים, הישרדות התא, תרדמת, ושגשוגם – כל פנוטיפים שתורמים להתפתחות של מחלה גרורתית מיקרו גרורתי וגלויה בכבד.

חשוב לשקול היבטים רבים של פרוטוקול הזרקה לווריד פורטל לפני ייזום מחקרים. בזהירות להחליט על שורות תאים, ריכוז תא, מספר תאים הכולל, נקודות קצה עניין על בסיס מחקרי גישוש קטנים מומלץ בחום. יתר על כן, שימוש מארחים מוסמכים חיסוניים שורות תאי syngeneic הוא בעל חשיבות עליונה להבנת אינטראקציות תא מארח-גידול. חדש שפותח "הראש זוהר" עכבר מבטא eGFP ו בלוציפראז מבלוטת יותרת המוח הקדמית הוא כלי חשוב עבור ביטול תגובות לארח אקסוגניים eGFP ו בלוציפראז, חלבונים משמשים לעתים קרובות כדי לתייג קווי חלב גידול 75 </sup>. שימוש בעכבר "הראש זוהר" ו syngeneic מתויג תאים סרטניים יקלו זיהוי קל של תאים מופצים יחיד מוקדי micrometastatic ידי IHC ללא החשש של תגובות דלקתיות כדי eGFP או בלוציפראז. בדומה לכך, בחירת אסטרטגיות ניהול כאב בקפידה כדי להבטיח אנטי מינימאליים או השפעה פרו-גידול מן משטר הטיפול התרופתי מומלצת בחום. צעדים קריטיים בפרוטוקול זה הנם עמיד בתנאים סטריליים ברחבי ניתוחים על מנת להבטיח הידבקות דבר זה אינו קורה, כמו זה יהיה לבלבל כל תוצאות. כמו כן, חשוב כי המחט ממוקמת כראוי וריד הפורטל על מנת להבטיח כי תאים סרטניים מועברים אל הכבד. תרגול הפרוטוקול עם צבעים כגון דיו הודו יעזור עם בעיה זו. צמיחת גידול באתר עור החתך היא האינדיקטור הטוב ביותר כי מיקום מחט פסול התרחש. לבסוף, זה קריטי, כי איבוד דם מעורק הפורטל נשלט כראוי וחדל לפני לחלוטין suturing החיה. שימוש גזה עוצרת דמום מאוד מפחית את הסיכון של איבוד דם בלתי מבוקר מעורק הפורטל לאחר הזרקה. בידיים שלנו, תמותה הקשורים פרוצדורליים בשל איבוד דם מן הזריקה הבאה וריד שער הופחת מ -30% ל 2% של עכברים עם השימוש גזה עוצר דמום.

חשוב לציין כי מודל הזרקה לווריד פורטל לא לשכפל את מפל גרורתי מלא, אך הוא מוגבל לחקר extravasation תאים סרטניים, אינטראקציות נישה תאים סרטניים הבאים extravasation והתפתחות הגידול. מודלים במדויק לשכפל את מפל גרורה המלא אל הכבד, כגון מתרחש בחולים, יש צורך דחוף. מגבלה נוספת של המודל הזרקה לווריד פורטל היא שזה בתוהו בשל השפעת הניתוח על המארח, בריפוי פצעים ידוע להשפיע התקדמות המחלה 76,77.

מודל ההזרקה לוריד הפורטל מהווה שיפור על הזרקה אחרתמודלים ללמוד גרורות בכבד, כולל intracardiac ומודלים intrasplenic. באופן ספציפי, מודל הזרקה לווריד הפורטל מאפשר לחקר מגוון גדול של התקדמות המחלה מאשר הדגם intracardiac, אשר מוגבל לעתים קרובות על ידי גרורות במקביל ברקמות אחרות. יתר על כן, מודל וריד השער לא מסובך על ידי הסרת הטחול, כפי שנעשה במודל intrasplenic.

מודל ההזרקה לוריד פורטל עשוי להוכיח כלי שימושי לחקר גרור בכבד בכלל. גרורות בכבד הוא האתר השכיח ביותר של גרורות אדנוקרצינומה הכוללת, עם צמיחה גבוהה במיוחד נרשמה סרטן הלבלב (85% בגרורות הם אל הכבד), המעי הגס אדנוקרצינומה של הרקטום (> 70%), כמו גם הקיבה הוושט (> 30 %) 1. למרות מודלי גידול ספונטניים orthotopic העיקריים של אדנוקרצינומה לבלב ומעי גס יותר בקלות גרורה בכבד 78,79, מודל ההזרקה לוריד הפורטל עשוי provדואר שימושי להבנת התהליך גרורתי של הסרטן אלה כפי במסירה מבוקרת של תאים סרטניים מאפשר הערכות ביוכימיים, מולקולריות היסטולוגית בזמנים מוגדרים לאחר הגעת תאים סרטניים. לסיכום, מודל ההזרקה לוריד הפורטל מהווה שיפור חשוב על מודלים גרורים בכבד זמין של סרטן השד, ויכול גם להיות ישים בתחום הגרור בכבד בכלל.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Alexandra Quackenbush for assisting with surgical procedures during filming of the video protocol, Hadley Holden for histological support, Sonali Jindal for input on tumor and liver pathology during method development, and Breanna Caruso for critical review of the manuscript. The D2A1 and D2.OR mammary tumor cells were a gift from Dr. Ann Chambers, the D2A1-GFP tumor cells were a gift from Dr. Jeffrey Green, and the 4T1 tumor cells were a gift from Dr. Heide Ford. The OHSU Advanced Light Microscopy Core at the Jungers Center was utilized for imaging. The work included in this manuscript includes funding from NIH/NCI NRSA F31CA186524 (to ETG) and NIH/NCI 5R01CA169175 (to PS).

Materials

1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle BD Syringe 309597 For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp
Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 06-669-62 For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile Kendall 8044 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears Rugby 370114 Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml Mfg. by Reckitt Benckiser NDC-12496-0757-1 Use at 0.05 – 0.1 mg/kg body weight, 1-2x daily for 72 hours, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) Mfg. by Humira Inc NDC-04091163-01 Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 ul injected subcutaneously at incision site 
anti-CD45 antibody BD Pharmingen 550539 Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze Medtrade Products Ltd. FG08839011 Cut into 5mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chemical Depilatory Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers
Chlorhexidine, 2% Solution Vet One 1CHL008 Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
anti-CK18 antibody Abcam ab53118 Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci
Cotton Tipped Applicators, Sterile Fisher Scientific 23-400-114 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose HyClone SH30243.01 Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03 Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile Kendall 2146 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
anti-Green Fluorescent Protein antibody Vector Laboratories BA0702 Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines
L-Glutamine 200 mM (100X) Gibco 25030-081 Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose
Heating Pad, x2-3 Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers
Hemocytometer Hausser Scientific 1483 For use in cell culture to count cells
Hemostatic Forceps Stainless steel; multiple suppliers
anti-Heppar-1 antibody Dako M7158 Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci
Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge BD   324702 For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp
Isoflurane Piramal NDC-66794-017-25 Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer VetEquip 911103 Use caution, vaporizes anesthetic gases
Light Source Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers
Neutral buffered formalin, 10% Anatech Ltd. 135 Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology
Opal™ 4-color fIHC kit PerkinElmer, Inc. NEL794001KT Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver
Operating Scissors Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers
Penicillin/Streptomycin, 100x Corning 30-002-Cl Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose
Phosphate-buffered Saline Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers
Removable Needle Syringe, 25 ul, Model 1702 Hamilton 7654-01 For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15 Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge Hamilton 7803-04 For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12°angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sodium Hypochlorite Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers
Sterile Saline Fisher Scientific BP358-212 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile Multiple suppliers
Sutures, Sterile  Ethicon J310H 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine VetEquip 901801 Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile  Dynarex 4410 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery
Trypan Blue Life Technologies T10282 For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) Gibco 25300-054 Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  2. Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
  3. Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
  4. Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
  5. Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
  6. Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
  7. Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
  8. Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
  9. Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
  10. Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
  11. Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer–a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
  12. Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
  13. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  14. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
  15. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  16. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
  18. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
  19. Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
  20. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
  21. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
  22. Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
  23. Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
  24. Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
  25. Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
  26. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
  27. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
  28. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
  29. Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489 (2014).
  30. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
  31. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
  32. Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
  33. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
  34. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  35. Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
  36. Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
  37. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
  38. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
  39. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
  40. Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
  41. Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
  42. Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
  43. Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
  44. Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
  45. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260 (2012).
  46. Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
  47. Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
  48. Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
  49. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
  50. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677 (2014).
  51. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
  52. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  53. Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469 (2015).
  54. Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
  55. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  56. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
  57. Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
  58. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., Coligan, J. E. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
  59. Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
  60. Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
  61. Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
  62. Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
  63. Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
  64. Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960 (2015).
  65. Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35 (2016).
  66. Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
  67. Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
  68. O’Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
  69. Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
  70. Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
  71. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
  72. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
  73. Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
  74. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
  75. Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
  76. Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
  77. Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
  78. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
  79. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).

Tags

Portal Vein InjectionLiver MetastasisBreast CancerTumor CellsMurine ModelMetastatic CascadeCell ExtravasationCell SeedingCell DeathCell ProliferationCell DormancySurgical ProcedureAnatomical SurveillanceBalb/c MiceAnalgesiaDisinfectionIncisionTumor Cell Injection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (118), e54903, doi:10.3791/54903 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image