Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica⁺ Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

Las células T CD8 ⁺ comprenden un componente crucial del sistema inmune adaptativo ya que participan en la vigilancia inmune del tumor y contribuyen a la erradicación de patógenos intracelulares ^1. En términos simples, las células T CD8 ⁺ expresan receptores de células T (TCR) que reconocen específicamente de histocompatibilidad de clase complejo de péptido-major I (pMHC-I) moléculas presentes en la membrana plasmática de las células huésped. Dado que estos péptidos se derivan de la proteólisis de las proteínas sintetizadas endógenamente, pMHC-I de la superficie celular complejos proporcionan una ventana en el medio ambiente intracelular. Tras la infección por el virus, por ejemplo, las células infectadas se mostrarán moléculas MHC-I que contienen péptidos derivados de virus que pueden servir como ligandos para los TCR expresadas por patrullando las células T CD8 ^+. En el caso de un CD8 ⁺ de células T específica del virus se encuentra con una célula infectada presentar su ligando pMHC-I, compromiso TCR resultará en la activación de células T CD8 ⁺ y ultiinstancia conducir a la lisis de las células diana. Dada la naturaleza crítica de estas interacciones TCR / pMHC-I, la determinación de la magnitud, la especificidad y el fenotipo de la respuesta de células T CD8 ⁺ a menudo puede revelar pistas importantes sobre las enfermedades humanas.

Hasta principios de 1990, la cuantificación de las células T CD8 ⁺ específicas de Ag-basó en el ensayo técnicamente exigentes dilución limitante (LDA) ^2,3. No sólo se le requiere la LDA varios días para completarse, también se pudo detectar células que carecían de potencial proliferativo. Como resultado, la LDA enormemente subestimó la frecuencia real de las células T antígeno (Ag) específicos de CD8 ⁺ que participan en una respuesta inmune. Aunque el desarrollo de ELISPOT y ensayos de tinción intracelular de citoquinas mejora en gran medida la capacidad de medir la inmunidad celular, estos métodos aún requieren la estimulación in vitro para la cuantificación de células T específicas de ^Ag-4. No fue hasta 1996 que Altman, Davis, y coleagues publicaron su artículo de referencia informar el desarrollo de la tecnología de tetrámeros pMHC-I ^5. Crítica para el éxito de esta técnica fue la multimerización de las moléculas pMHC-I, que se extendían la vida media de las interacciones TCR / pMHC-I, lo que reduce la probabilidad de tetrámeros pMHC-I que caen fuera durante las etapas de lavado de ensayos de citometría de flujo. La principal ventaja de tetrámeros pMHC-I en los ensayos mencionados anteriormente es la capacidad para detectar con precisión las células T Ag-CD8 ⁺ específicas directamente ex vivo sin la necesidad de re-estimulación in vitro en. Por otra parte, la combinación de pMHC-I tinción tetrámero con multi-color de citometría de flujo ha permitido un análisis detallado de la etapa de diferenciación, fenotipo de memoria, y el estado de activación de ⁺ células T CD8 específicas de ^Ag-2-4. A la luz de los recientes avances técnicos para la caracterización de los repertorios de células T CD8 ⁺ por pMHC-I tinción multímero ^6, la amplitud de las aplicaciones for esta metodología es probable que continúe en expansión.

Pocas áreas de la investigación biomédica han beneficiado más de pMHC-I tinción tetrámero que el campo de la inmunología del VIH ^7. A pesar de que las células T CD8 ⁺ se habían asociado temporalmente con el control inicial de la viremia del VIH en el momento de la publicación por Altman, Davis y sus colegas ^8,9, el uso de tetrámeros pMHC-I en los años siguientes se expandió significativamente nuestra comprensión de el VIH-específica respuesta de células T CD8 ^+. Por ejemplo, pMHC-I tinción tetrámero ayudó a confirmar el tamaño robusta de las respuestas de células T específicas del virus CD8 ⁺ en la mayoría de las personas infectadas por el VIH ^10-12. Esta metodología también facilitó la caracterización del VIH y las respuestas de células T CD8 ⁺ específicas SIV-restringidos por moléculas MHC-I asociados con el control de la replicación viral espontánea en ausencia de terapia antirretroviral, un fenómeno conocido como "control de la élite" <sup> 13-15. Además, tetrámeros pMHC-I fueron instrumental en el establecimiento del eje muerte programada de 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) como vía reversible para el fenotipo disfuncional de ⁺ específicas del VIH CD8 células T en la infección crónica no controlada ^16,17. En conjunto, estos estudios ponen de relieve la utilidad de tetrámeros pMHC-I para el seguimiento de las respuestas de células T CD8 ⁺ contra el virus del SIDA.

La infección experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) sigue siendo el mejor modelo animal para la evaluación de las intervenciones inmunológicas contra el VIH / SIDA ^18,19. En los últimos 25 años, se ha hecho un progreso sustancial en la identificación y caracterización de las células T SIV-CD8 ⁺ específicas en esta especie de monos, incluyendo el descubrimiento de alelos MHC-I y la definición de la unión de péptidos motivos ^13,20-27 . Como resultado, tetrámeros pMHC-I se han desarrollado para el análisis de específica SIV ⁺ de células T CD8respuestas en este modelo animal ^28. La mayoría de estos reactivos se hacen de los productos génicos de cuatro macacos rhesus alelos MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, y Mamu-B * 017: 01. Es de destacar que los macacos rhesus no expresan un locus MHC-C ^29. La gran mayoría de los tetrámeros pMHC-I utilizados en los presentes experimentos se produjeron en el Centro de NIH tetrámero Núcleo de la Universidad Emory. Sin embargo, algunos de estos reactivos, incluyendo Mamu-A1 * 001 tetrámeros con destino a la inmuno epítopo Gag CM9, sólo puede obtenerse de fuentes comerciales, debido a los acuerdos de licencia. Utilizando tetrámeros pMHC-I de los cuatro alelos macacos rhesus enumerados anteriormente, hemos registrado con éxito las células T CD8 ⁺ contra un total de 21 epítopos SIV (Tabla 1), que fueron inducidos por la vacunación o infección primaria SIV ^30,31 (Martins et al., observaciones no publicadas).

El presente manuscrito proporciona unaprotocolo de tinción de tetrámero optimizado pMHC-I para la determinación del fenotipo de frecuencia y la memoria de las células T CD8 ⁺ específicas de SIV en macacos rhesus. El ensayo comienza con una electiva 30 min de incubación con un inhibidor de la proteína quinasa (PKI; aquí, se utiliza dasatinib) con el fin de disminuir TCR internalización y con ello mejorar pMHC-I tetrámero tinción ^32. Como se describe a continuación, este tratamiento es especialmente útil cuando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrámeros. También se proporcionan instrucciones sobre cómo marcar las células con tetrámeros pMHC-I conjugados con fluorocromo y anticuerpos monoclonales (MAB). Este protocolo también incluye una etapa de permeabilización celular para la detección intracelular de la citolisis asociada molécula de granzima B (Gzm B). El mAb contra CD3 se añade en este paso también para mejorar la detección de esta molécula de señalización del TCR. Como referencia, se enumeran todos los fluorocromos utilizados en este panel de tinción.