L'analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8⁺ T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione

CD8 ⁺ T-cellule comprendono una componente fondamentale del sistema immunitario adattativo, come partecipano tumore sorveglianza immunitaria e contribuire alla eradicazione di patogeni intracellulari ^1. In termini semplici, CD8 ⁺ T-cellule esprimono i recettori delle cellule T (TCR), che riconoscono specificamente di istocompatibilità di classe complessi peptide-major I (pMHC-I) molecole presenti sulla membrana plasmatica delle cellule ospiti. Poiché questi peptidi sono derivati ​​dalla proteolisi di proteine ​​sintetizzate endogeno, pMHC-I superficie cellulare complessi forniscono una finestra nell'ambiente intracellulare. Al momento l'infezione da virus, per esempio, le cellule infettate mostrerà molecole MHC-I contenenti peptidi del virus di derivazione che possono servire come leganti per TCR espresse da pattugliamento CD8 ⁺ T-cellule. Nel caso in cui un CD8 ⁺ cellule T specifiche per il virus incontra una cellula infetta presentando il suo ligando pMHC-I, TCR impegno si tradurrà in attivazione ⁺ cellule T CD8 e ultinell'intervallo portare a destinazione la lisi cellulare. Data la natura critica di queste interazioni TCR / pMHC-I, che determina la grandezza, la specificità, e fenotipo di rispondere CD8 ⁺ T-cellule possono spesso rivelare importanti indizi circa le malattie umane.

Fino ai primi anni 1990, la quantificazione di Ag-specifici CD8 ⁺ T-cellule invocato il saggio tecnicamente impegnativo diluizione limite (LDA) ^2,3. Non solo la LDA ha richiesto diversi giorni per essere completato, ma anche omesso di rilevare le cellule che mancava potenziale proliferativo. Come risultato, la LDA notevolmente sottovalutato la frequenza effettiva di antigene (Ag) specifico d'CD8 ⁺ T-cellule che partecipano a una risposta immunitaria. Sebbene lo sviluppo di ELISPOT e dosaggi di citochine colorazione intracellulare notevolmente migliorato la capacità di misurare l'immunità cellulare, questi metodi ancora necessari a stimolazione in vitro per la quantificazione Ag-specifiche cellule T ^4. Non è stato fino al 1996 che Altman, Davis, e Colleagues pubblicato il loro punto di riferimento articolo segnalato la sviluppo della tecnologia tetramero pMHC-I ^5. Fondamentale per il successo di questa tecnica è stata la multimerizzazione delle molecole pMHC-I, che si estendevano l'emivita delle interazioni TCR / pMHC-I, riducendo così la probabilità di tetrameri pMHC-I cadono fuori durante le fasi di lavaggio dei dosaggi di citometria a flusso. Il vantaggio principale di tetrameri pMHC-I sopra i saggi suddetti è la capacità di rilevare con precisione Ag-specifica CD8 ⁺ T-cellule direttamente ex vivo senza la necessità di in vitro ri-stimolazione. Inoltre, la combinazione di pMHC-I tetramero colorazione con multicolore citometria a flusso ha consentito analisi dettagliate della fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione di Ag-specifici CD8 ⁺ T-cellule ^2-4. Alla luce dei recenti progressi tecnici per la caratterizzazione repertori ⁺ CD8 T-cellule da pMHC-I Multimer colorazione ^6, l'ampiezza di applicazioni FOR questa metodologia è destinata a continuare in espansione.

Poche zone nella ricerca biomedica hanno beneficiato di più dal pMHC-I tetramero colorazione di campo dell'HIV dell'immunologia ^7. Anche se CD8 ⁺ T-cellule erano state temporalmente associato al controllo iniziale di viremia HIV dal momento della pubblicazione da Altman, Davis, e colleghi hanno ^8,9, l'uso di tetrameri pMHC-I, negli anni successivi notevolmente ampliato la nostra comprensione di HIV-specifica CD8 ⁺ risposta T-cellulare. Ad esempio, pMHC-I tetramero colorazione aiutato confermare la dimensione robusta di risposte delle cellule T virus-specifici CD8 ⁺ nella maggior parte delle persone con infezione da HIV ^10-12. Questa metodologia anche facilitato la caratterizzazione di HIV e SIV-specifici ⁺ risposte delle cellule T CD8 limitato da molecole MHC-I associate al controllo spontaneo della replicazione virale in assenza di terapia antiretrovirale, un fenomeno noto come "controllo elite" <sup> 13-15. Inoltre, pMHC-I tetrameri hanno contribuito a stabilire l'asse morte programmata 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) come un percorso reversibile per il fenotipo disfunzionale di ⁺ HIV-specifica CD8 T-cellule nel infezione cronica non controllata ^16,17. Collettivamente, questi studi sottolineano l'utilità di tetrameri pMHC-I per monitorare le risposte delle cellule T CD8 ⁺ contro il virus dell'AIDS.

Sperimentale infezione SIV di macachi Rhesus (Macaca mulatta) rimane il migliore modello animale per la valutazione degli interventi del sistema immunitario contro l'HIV / AIDS ^18,19. Negli ultimi 25 anni, sono stati compiuti notevoli progressi nella identificazione e caratterizzazione di SIV-specifica CD8 ⁺ T-cellule in questa specie di scimmie, tra cui la scoperta di alleli MHC-I e la definizione di binding peptide motivi ^13,20-27 . Come risultato, pMHC-I tetrameri sono stati sviluppati per l'analisi di SIV-specifica CD8 ⁺ T-cellulerisposte in questo modello animale ^28. La maggior parte di questi reagenti sono realizzati i prodotti genici di quattro macaco rhesus alleli MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. Da segnalare, macachi Rhesus non esprimono un MHC-C locus ^29. La stragrande maggioranza dei tetrameri pMHC-ho utilizzato nelle attuali esperimenti sono stati prodotti presso l'impianto di NIH Tetramero core alla Emory University. Tuttavia, alcuni di questi reagenti, compresi Mamu-A1 * 001 tetrameri legati alla immunodominante epitopo Gag CM9, può essere ottenuto solo da fonti commerciali a causa di accordi di licenza. Uso tetrameri pMHC-I dei quattro alleli macaco rhesus elencati sopra abbiamo elencato con successo CD8 ⁺ T-cellule contro un totale di 21 epitopi SIV (Tabella 1), che sono stati indotta dalla vaccinazione o infezione primaria SIV ^30,31 (Martins et al., osservazioni non pubblicate).

Il presente manoscritto fornisce unaottimizzato protocollo tetramero colorazione pMHC-I per determinare il fenotipo frequenza e la memoria di SIV-specifici CD8 ⁺ cellule T nei macachi rhesus. Il test inizia con un elettivo 30 min di incubazione con un inibitore della proteina chinasi (PKI, qui, Dasatinib è utilizzato) al fine di diminuire TCR internalizzazione e quindi migliorare pMHC-I tetramero colorazione ^32. Come descritto di seguito, questo trattamento è particolarmente utile quando si utilizza Mamu-B * 017: 01 tetrameri. Sono inoltre disponibili le istruzioni su come etichettare le cellule con tetrameri pMHC-I coniugato a un fluorocromo e anticorpi monoclonali (MAK, MAB). Questo protocollo include anche un passo permeabilizzazione cella per la rilevazione intracellulare della citolisi associata molecola granzyme B (GZM B). Il mAb contro CD3 viene aggiunto in questa fase anche per migliorare la rilevazione di questa molecola di segnalazione TCR. Come riferimento, vengono elencati tutti i fluorocromi impiegati in questo pannello colorazione.