Иммуноокрашивание Biocytin заполненных и переработанным секций для нейрохимических маркеров

Мозг известен разнообразием в структурных и функциональных характеристик отдельных его элементов нейрональных. Понимание роли различных типов нейронов в функции мозга и патологии требует определения характеристик и однозначной идентификации нейронов. Конструктивно, морфологические признаки, определяемые сомато-дендритной месте определить потенциальные входы, которые получает данный нейрон, в то время как модель аксонов разветвление выявляет потенциальные постсинаптические цели. Структурное разнообразие нейронов была оценена со времен семенных гистологических исследований Рамона Кахаль в ^1. Появление методов записи одноклеточных показало, что структурно различные нейроны также показывают различия в характере обжига и синаптических характеристик. Разнообразие в структуре и физиологии особенно проявляется в ГАМКергических тормозных нейронов ^2,3. Кроме того, она становится все более очевидным, что конструкционнаяу аналогичные нейроны могут выражать различные нейрохимические маркеры и показать соответствующие функциональные ⁴ различия. Точно так же, нейроны с теми же нейрохимических маркеров могут иметь различные структуры и функции ^5-10. Таким образом, на практике, анализ функциональных характеристик нейронов и их роли в сети влечет за собой устанавливает их морфологические и нейрохимические идентичностей. Даже с появлением репортерных мышей линий , ориентированных на конкретные нейрохимические маркеры, часто бывает необходимо определить морфологию и идентичность подтипа основана на иммуногистологии ^11.

Стандартный метод, используемый для характеристики клеток, записанные в острых срезах мозга, чтобы наполнить их biocytin или neurobiotin во время записи, фиксации секций в параформальдегида (PFA) следующие записи, а также использовать иммуногистохимии для выявления морфологии и нейрохимические. Так как толщина секций для среза физиологии, как правило, 300 мкмили более, и потому , что большинство антител не проникают полностью через эту глубину, кусочки должны быть повторно разрезали до 60 мкм или менее , чтобы обеспечить одновременное иммуногистохимическое biocytin и нейрохимических маркеров ^12-14. К сожалению, это трудоемкий резекции; риски потери ткани во время секционирования; и может привести к неравномерная усадка ткани, усложняя морфологическими реконструкций. Кроме того, предварительное знание морфологии может помочь сузить маркеры кандидатов, которые могут быть выражены клетками. Мы модифицировали стандартные протоколы biocytin Иммуногистология, чтобы позволить последовательной обработке секций первого для восстановления морфологии, а затем для идентификации потенциальных нейрохимических маркеров.

Иммуногистохимия является изучение распределения антигенов в тканях или клетках и могут быть визуализированы с использованием фермента, флуоресцентные метки, радиоактивные элементы или частицы золота коллоидных ^15. Процедура яnvolves с использованием первичных антител, специфически метит и усиливать один или более специфических антигенов, с последующим использованием флуоресцентных вторичных антител, направленных первичное антитело для визуализации. Из-за необходимости различать спектры флуоресценции каждого вторичного антитела не перекрывали друг друга, только ограниченное количество антигенов, могут быть рассмотрены одновременно. Таким образом, предварительное знание морфологии может быть полезным при выборе кандидата нейрохимические маркеры для классификации клеток. Концептуально, Обоснованием последовательной обработке уже окрашенных участков основана на предпосылке , что иммунноокрашивания для одного белка или пептида , не должны мешать антигенных свойств и последующей иммунноокрашивания для структурно – независимого пептида ^16. Это отсутствие помех из-за связывания антител к специфическим белком эпитопом на антигене, и, следовательно, позволяет одновременно окрашивании нескольких антигенов в той же ткани. Количество антигенов revealed иммунным окрашиванием ограничена необходимостью неперекрывающихся спектров флуоресцентных вторичных антител и необходимостью неадресный антигенов с антителами , индуцированными у разных видов , с тем чтобы устранить перекрестную реактивность ^17,18. В то время как это рассуждение позади последовательного, а не одновременного мечения с двумя различными антителами, которые могут взаимодействовать, насколько нам известно, иммуногистохимическое второго антигена не сообщалось после завершения иммунноокрашивания для одного или нескольких антигенов на смонтированных участках. Здесь мы опишем метод последовательного иммунным ранее окрашенных и смонтированных секций. В то время как мы подробно этот процесс последовательной процедуры иммунноокрашивания для восстановления морфологии с последующим окрашиванием на белок / пептидных маркеров в толстых секций, одни и те же процедуры могут быть использованы в стандартных, тонкие гистологические срезы, а также. Кроме того, мы опишем практический подход, чтобы заполнить записанные нейроны с biocytin и процессом вытеснитьэлектрода из клетки после завершения записи , чтобы оптимизировать заполнение аксонов и дендритных беседок нейронов, как это представлено в нашей недавней работе ^6,8.

Самым важным преимуществом способа, описанного здесь, является то, что морфология записанном клетки могут быть полностью восстановлены и отображены перед попыткой резекции или immunostain ломтиков. Хотя проблемы с проникновением определенных антител может сделать необходимым резекция срезах для вторичного иммунным окрашиванием, процедуры, подробно здесь устранит необходимость перестройки сложных нейронов из нескольких секций, и позволит избежать проблем из-за потери ткани и дифференциальной усадки, которая может поставить под угрозу восстановление Следующий резекции. Дополнительным преимуществом является то, что процесс приведет к сокращению затрат, времени, усилий и дорогостоящих антител путем ограничения иммуноокрашивания и повторно секционирования на ломтики, в котором восстанавливаются biocytin заполненные нейроны. Наиболее практичным аспектом является объявлениеНАЯ иммунное, которые могут быть выполнены на срезах, окрашенных месяцев перед использованием вышеупомянутой методики. В частности, восстановление морфологии бы значительно уменьшить потенциал, что физиологические данные из клеток, отвергнутых из-за невозможности получить базовый уровень морфологическую характеристику типа клеток.