접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
미세 유기체의 수준에서의 유전자 및 단백질의 전사는 박테리아의 생존과 발전뿐만 아니라 감염 과정에서 중요한 역할을한다. 박테리아 사이 또는 박테리아 및 세포 간 DNA의 교환은 변형, 결합, 벡터 전달을 통해 달성 될 수있다. 1,2- 활용은 대장균 등의 그람 음성균 간의 접합시 점에서 변환 및 전달에 비해 독특 DNA의 전사는 복합 고분자 시스템 공여자와 전지를 연결함으로써 도너 – 제어 방식으로 발생한다. 활용은 박테리아 세포는 호스트 시스템에서 유전자, 단백질 또는 화학 물질을 주입하는 숙주 세포와 상호 작용하는 가장 직접적인 방법입니다. 3 종종, 이러한 에이전트의 전송은 진화와 적응을 호스팅하는 기전과 발암에 이르기까지 호스트에 놀라운 효과를 가지고있다. 그것은 그 공역 recombinatio을 보였다n은 환경 스트레스 조건에서 높은 돌연변이 속도와 박테리아에 적응 3 배의 속도를 증가시킨다. (4) 또한, 접합은 균주의 항생제 내성 유전자가 확산되는을 통해 지금까지 가장 일반적인 경로입니다. 5,6
미생물 세포막 전체 거대 분자의 전달을 지원하기 위해 특수 분비 시스템 진화; 설명 된 그람 음성 세균에서 분비 시스템 (TSSs)의 9 종류의 현재 위치 : T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS뿐만 아니라 초 (분비)과 문신이 (두 아르기닌 전위) 경로. 분비 시스템의 7,8 각 유형은 또한 다른 균주에 의한 단백질의 다양성과 관련된 경로의 특수성에, 다른 하위 유형으로 필요성을 분할된다. 예를 들어, 타입 IV 분비 시스템 (T4SS)에있어서, Ti 및 CAG 시스템은 F-플라스미드 반면 이펙터 전송을 용이 R27 A를차 pKM101 T4SSs는 공역 플라스미드의 이동을 용이하게한다. 생물받는 사람이나 자신의 주변 환경과 휴대 내용을 자신의 구성 요소 단백질에서 각각 분비 시스템을 조립하고 공유하는 메커니즘의 7,9,10 자세한 이해는 병원성 미생물의 프로세스에 대처하기 위해 대상 전략의 개발에 중요한 요소이다 세포 감염.
Lederberg 및 테이텀 (11)에 의한 대장균의 초기 식별 접합 다음 모바일 공역 플라스미드 다수 확인되고 특성화되었다. (12) 이러한 모바일 플라스미드 그러나 모든 모바일 플라스미드 전송 (기술 Orit)하여 플라스미드의 전송을 가능하게하는 근원을 인식하는 relaxase를 포함, 상당한 범위 (1에서 200 킬로베이스 (킬로바이트)로) 크기가 표시됩니다. 공역 기능 T4SS 조립 용 플라스미드를 더 인코딩 유전자뿐만 아니라, 형IV 결합 단백질. 도 12는 예를 들어 대장균 100킬로바이트 F 플라스미드 33.3 kB의 전송 (TRA) 영역 내의 모든 공역 유전자를 암호화한다. 13 쌍의 형성 (MPF), DNA 전송 및 제외 기능을 짝짓기 pilus 형성을 촉진 모든 단백질 공역 플라스미드 전송시 F 플라스미드 인코딩의 TRA 지역에서 유전자. 10,14,15 지식의 중요한 몸은 공역 T4SSs 사용할 수 있습니다, 그러나 단지 최근에 사용 가능한되고있다 공역 단백질 복합체의 구조 연구를 설명. 16-28
공역 처리의 광범위한 관점을 조립하기 위해, 전사 공역 단백질의 돌연변이를 분석하는 상세한 구조 연구의 결합이 필요하다. 이 공역 정합 분석을 통해 달성 될 수있다. 은 F 플라스미드를 들어, TRA 영역 내에 인코딩 각 단백질은 F-CO 매개하는 역할njugation; 따라서, 전달 유전자의 녹아웃 / 삭제 셀 (도 1)의 공역 용량을 폐지 할 것이다. 작은 이동 플라스미드는 F와 같은 큰 공역 플라스미드위한 표준 삭제 절차에 더 도움이되는 동안 표적 유전자는 하나의 별개의 항생제 내성 유전자를 전달로 치환되는 경우, 유전자 녹아웃보다 쉽게 상동 재조합을 통해 달성된다. 현재의 프로토콜에서, 우리는 55킬로바이트 F 플라스미드 유도체 pOX38-TC의 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제 (CAT)와 관심 전사 유전자를 대체하는 상동 재조합을 사용; 29,30 얻어진 녹아웃 플라스미드 pOX38-TC Δgene :: 형상은 성장 배지에 클로람페니콜의 존재 (CM)로 저항을 용이하게한다. pOX38-TC Δgene :: CM 은닉 공여 세포는 결합 분석을 사용하여 관찰 공역 DNA 전달 / 결합에 영향을 줄 수 없다; pOX38-TC Δgene :: 형상 도너 셀의 결합 효율과 정상 RECIPient 더 자주, 폐지, 감소 또는 것입니다. pOX38-TC Δgene : CM 플라스미드의 공역 전송이 대상 전송 유전자를 품고 작은 복구 플라스미드를 통해 복원 할 수 있습니다. 이 복구 플라스미드는 플라스미드 pK184 (pK184 유전자), 31 또는 너무 오래 그 플라스미드가 제대로 셀 (세포질이나 주변 세포질) 내에서 올바른 위치에 유전자를 표적으로 유도 식을 제공 하나, 구성 적 발현을 제공 하나가 될 수 있습니다. 따라서,이 새로운 기증자 사이의 결합 분석에서 (pOX38-TC Δgene : CM + pK184 유전자 플라스미드를 은닉) 과받는 사람의 세포가 결합 효율은 거의 그 정상 기증자받는 사람 짝짓기 분석의 복원 것으로 예상된다. 이 시스템은 pK184 유전자 작 제물 (결실 또는 점 돌연변이)의 일련의 생성을 통해 기절 유전자의 기능을 검사하고 pOX38-TC Δgene :: 형상 은닉의 결합 용량을 복원하는 각 구조체의 능력을 테스트 한있게 기증자 세포에스.
Protocol
Representative Results
Discussion
접합 공정은 박테리아와 같은 항생제 내성 마커의 확산 등의 어려운 환경에서 성장을 위해 진화하는 장점을 제공하는 유전자를 확산 할 수있는 수단을 제공한다. 공역 플라스미드 많은 너무 크기 때문에, 공역 플라스미드 자체의 표적 유전자의 돌연변이를 통해 전송 장치의 조립에 관여하는 단백질의 기능 연구 12 다루기이다. 본원에 설명 된 프로토콜을 하나 더 쉽게 더 작고 관리 발현 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학위원회에서 발견 그랜트 (NSERC)에 의해 지원되었다.
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
References
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
- Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
- Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
- Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
- Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
- Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
- Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
- Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
- Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
- Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
- Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
- Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
- Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
- Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
- Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
- Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
- Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
- Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
- Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
- Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
- Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
- Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
- Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
- Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
- Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
- Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
- Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).
