高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

細胞内区画に一時的に成長するか、存在する病原体が治療根絶することは困難です。義務または比較的ようなレジオネラ・ニューモフィラ 、Q熱リケッチア 、 ブルセラ属などの細胞内病原体を義務づけます。 、野兎病菌 、およびマイコバクテリウム属 。多くの場合、数ヶ月から数年もの範囲とすることができる治療法のための抗菌薬治療の長期のコースを必要とします。さらに、細胞外病原体は、一過性の細胞内ニッチを占め、このように抗菌薬治療の通常のコースによってクリアランスを逃れ、後に病原性感染症の新しいラウンドを開始するために出てくることがあります。 黄色ブドウ球菌 ¹及び尿路病原性腸内細菌^2,3感染は2ますます認識の例です。したがって、基本的な薬物発見の目的は、細胞内コンパートメントに浸透新規な抗菌剤を同定することです。迅速に根絶するための最適な治療法細胞内の生物サブ抑制抗菌剤暴露による耐性の発生を防止するには、特に望ましいです。

この目的のために、我々は、モデル病原体、 レジオネラ・ニューモフィラの細胞内増殖を標的細胞内浸透抗菌剤を同定するためのハイスループットスクリーニング技術を開発しました。 ⁴前臨床観察は、標準的な抗菌薬感受性試験は、正確にこの生物に対してインビボ治療効果が予測しなかったことを示しています。このようなβラクタムおよびアミノグリコシドなどの抗菌剤の主要なクラスは、無菌的に成長したレジオネラ菌に対して非常に有効であるが、十分にレジオネラ菌が存在する細胞内コンパートメント内に侵入しないため、 ^図5は、具体的には、これがありました。 ^5,6後で証拠は、技術的に、より複雑な細胞内増殖アッセイが効果的に臨床効果を予測することが示唆されました。 ⁷ </sup>残念ながら、これらのアッセイは、コロニー形成単位の計数のために、異なる時間点で、溶解する抗菌剤で処理された感染したマクロファージを、必要とする非常に面倒なエンドポイントアッセイは、ありました。このようなアッセイは、大規模に行うことは非現実的であり、高スループットの薬物発見のために不適当です。

したがって、我々は、細胞内細菌増殖のリアルタイム決意する技術を開発しました。 ⁶これは^、4または蛍光タンパク質⁹レポーター（ここで説明した第二世代、直交アッセイは、）は、細菌染色体に細菌ルシフェラーゼオペロン^8（前述した第1世代のアッセイ）のいずれかの統合により改変された細菌株の使用を通じて達成されました。このように、発光または蛍光シグナルは、細菌数のサロゲート、リアルタイムの読み出しを提供します。

しかし、これらの属性は、細胞内infectioの主要な交絡因子に対応していません宿主細胞上のnアッセイ、オフターゲット効果。具体的には、宿主細胞の死は、本質的に細胞内増殖を制限し、抗菌効果の偽陽性の同定をもたらします。スクリーニングライブラリのように多くの化合物は、毒性の真核細胞であり、このような偽陽性は、解決のためのフォローアップ、エンドポイントの細胞毒性アッセイを大量に必要と、真の抗菌剤を圧倒だろう。

これにより、同時に、真核生物細胞の生存および細胞内増殖を評価できることが非常に重要でした。注目すべきことに、非生存真核細胞の特性は、細胞膜の完全性の喪失です。細胞膜の透過性を試験するプローブは、したがって、細胞の生存率を評価するために使用されてもよいです。我々は、以前にアクセスし、死細胞の核DNAを染色する推定細胞膜非透過性、蛍光DNA結合色素の一連の能力を特徴とします。 ⁴核DNAを結合すると、これらの染料はquantuの大幅な増加を表示しますバックグラウンド溶液蛍光にわたって増加したシグナルが得られメートル蛍光収率。このように、これらの色素は、真核細胞死の定量的な読み出しを提供しました。 ^4は注目すべきことに、我々はいくつかは、J774マクロファージとの長時間の同時インキュベーションの間に自分自身に非毒性であることがわかりました。初期感染の間に添加された場合、それらは、マイクロプレート蛍光光度計により測定又は顕微鏡で観察することができる真核細胞死のリアルタイム蛍光読み出しが得られました。

従って、細菌のレポーターおよび非毒性、膜非透過性、DNA結合色素の使用を組み合わせることにより、我々は、同時に細菌負荷および真核細胞毒性の両方を測定するための簡単な、非破壊、リアルタイムアッセイを開発することができました。このアッセイは、私たちは〜250抗菌剤との細胞内増殖を阻害する能力のために機能的に特徴付けられていない活性を有する>24万小分子を含む384ウェルプレートフォーマット〜万知られている生物活性物質にスクリーニングすることができましたレジオネラ・ニューモフィラ 、同時に、各化合物の真核細胞の細胞毒性データを生成します。 ⁶ レジオネラ菌の細胞内増殖に対する既知の抗菌剤の我々の分析は、これまでのこのタイプの最も包括的な探査ました。 ⁶

組み合わせて使用​​する我々のアッセイフォーマットの効率に基づいて、我々はまた、続いて既知の抗菌剤の潜在的な相乗効果を調査しました。最も一般的な相乗作用試験の一つ、いわゆるチェッカーボードアッセイは、標準的に二つ以上の抗菌剤の二倍連続希釈の組み合わせ効果を評価することによって行われます。二つ以上の抗菌剤を別々に適用各々の効果の和よりも一緒に適用されたときに、これらのアッセイでは^{、図10に示すように} 、相乗効果は、より大きな効果を観察することにより定義されます。注目すべきは、これまで、唯一の集中と選択の相乗試験は、細胞内のレジオネラ・ニューモに対して行いました</em>が必要な組合せの順列を乗じた伝統的なエンドポイントアッセイに関与して多大な努力のため。

相乗効果のテストを容易にするために、我々は、自動化されたデジタルディスペンシング技術⁶との組み合わせで、当社のリアルタイム細胞内増殖/真核生物の細胞毒性アッセイを利用しました。この自動化は、384ウェル形式でDMSO単独の水溶液で、または組み合わせ中に溶解した化合物の連続希釈液を分配するために、私たちを可能にしました。 ^11はまた、このような強固な液体処理技術は、簡単に、より高い解像度を実行するために私達を許可し、平方根-の-2（むしろ標準よりも、低い解像度、倍増）我々の2つの次元で特異性の高いレベルを達成するために希釈組み合わせを、チェッカーボード相乗効果分析。この解像度が2倍希釈系列^12を使用した場合の再現性についてのシナジーフィールドの懸念に対処する上で特に有用でした。最後に、私たちのアッセイは、定量的ともTHERましたEFORE阻害の階調を測定しました。その結果、アッセイは、成長阻害の同様のレベルでのコンビナトリアル濃度を接続アイソコンターする等高線アイソボログラムで発現抑制情報の全体を、捕獲しました。 ⁶このプロット戦略は組み合わせ用量反応曲線の可視化を可能にしました。我々の方法論を例示するために、我々は、これらのアッセイを実施するための我々のプロトコルを記述し、代表的な結果を示します。