Misura della differenzialmente metilato<em> INS</em> DNA Specie in campioni di siero umano come una cellula morte biomarker di Islet β
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
Il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) è una malattia autoimmune che si caratterizza per la distruzione di isolotto che producono insulina β cellule da parte delle cellule T autoreattive 1. La diagnosi di diabete di tipo 1 è in genere effettuato al momento della misurazione della (glicemia> 200 mg / dl) iperglicemia in una magra, giovane individuo, che potrebbe presentarsi con chetoacidosi come prova di deficit di insulina. Al momento della diagnosi di diabete di tipo 1, vi è evidenza di sostanziale perdita della funzione delle cellule β e la massa (dal 50 – 90%) 2. Negli studi clinici, diversi farmaci modulatori immunitario che sono stati istituiti al momento della diagnosi ha portato alla stabilizzazione della funzione delle cellule β (e presumibilmente di massa), ma nessuno ha portato a remissione clinica della malattia, una scoperta che ha sollevato la chiamata per lo sviluppo di biomarcatori per la diagnosi precoce della malattia e per il tracciamento longitudinale efficacia di terapie combinate 3,4. Gli sforzi da consorzi internazionali, come ad uns Consorzio Research Network Islet Umana presso il National Institutes of Heath 5, hanno sottolineato la necessità di sviluppare biomarcatori che si concentrano sullo stress delle cellule β e la morte nel diabete di tipo 1.
In linea con questi sforzi, il nostro gruppo ed altri hanno recentemente sviluppato test biomarker che misurano circolanti, frammenti di DNA epigeneticamente modificati che nascono principalmente da morire le cellule beta 6-9. In tutti i saggi pubblicati fino ad oggi, il focus è stato sul quantificazione del gene umano codifica preproinsulina (INS), che dimostra maggiori gradi di non metilato siti CpG nelle regioni codificanti e promotore rispetto ad altri tipi di cellule. La liberazione di non metilato frammenti di DNA INS stato ipotizzato come derivanti principalmente dalla morte (necrosi, apoptosi) delle cellule beta. I nostri studi recenti hanno dimostrato che in gioventù, l'innalzamento di DNA sia metilato e metilato INS in posizione -69 bp (rispetto a tegli trascrizionale inizio sito) sono stati osservati in nuova insorgenza diabete di tipo 1, e insieme servito biomarcatori come specifici per questa popolazione 6. Questi dosaggi biomarker comportano l'isolamento di DNA cell-free dal siero o plasma utilizzando kit di spin commerciali, seguita da una conversione bisolfito del DNA isolato (per convertire cytosines non metilato per uracils, lasciando cytosines metilati intatto).
In questo rapporto, descriviamo gli aspetti tecnici della raccolta dei campioni di siero, l'isolamento del DNA cell-free dal siero, la conversione bisolfito, e le prestazioni di goccioline PCR digitale (d'ora in poi, PCR digitale) per differenziale metilato INS DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metilazione del cytosines di DNA metiltransferasi permette il controllo epigenetico della trascrizione in molti geni. Il gene INS nell'uomo è espresso quasi esclusivamente in isolotto β cellule, e sembra che vi sia una correlazione tra la frequenza di metilazione del cytosines nel gene INS per silenziamento della sua trascrizione 11. Come tale, la maggior parte dei tipi di cellule mostrano sostanzialmente frequenze più elevate di metilazione del gene INS a vari cytosines r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
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