Farklı Olarak metile ölçümü<em> INS</em> Bir Biyomarker Islet β Hücre Ölümü İnsan serum Örnekleri DNA Türler
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
Tip 1 diyabet (T1D) oto-reaktif T hücreleri 1 hücrelerden β insulin üreten bağımsız tahrip edilmesi ile karakterize edilen bir otoimmün hastalıktır. T1D tanısı tipik insülin eksikliği delil olarak ketoasidoz ile karşımıza olabilir yalın, genç birey, hiperglisemi (kan şekeri> 200 mg / dl) ölçümü üzerine yapılır. Tip 1 diyabetin tanısı zamanda, β hücre fonksiyonu ve kütlenin önemli bir kayıp kanıtlar vardır (50 -% 90) 2. Klinik çalışmalarda, tanı anında tesis edildi birkaç immün modülatör ilaçlar, hastalığın klinik remisyon sonuçlanmıştır β hücre fonksiyonu (ve muhtemelen kütle), ancak hiçbiri stabilizasyonu geliştirilmesi için çağrı yükseltti bir bulgu sonuçlandı hastalığın erken tespiti için ve için biyomarkerların kombinasyonun etkinliği uzunlamasına izleme 3,4 terapiler. uluslararası konsorsiyumlar tarafından çabalar, böyle birHeath 5 National Institutes of Human Adacık Araştırma Ağı Konsorsiyumu s, T1D içinde β hücre stres ve ölüm odaklanmak Biyobelirteçleri geliştirilmesi gerektiğini vurgulamışlardır.
9 – Bu çalışmalar doğrultusunda, grubumuz ve diğerleri son zamanlarda β hücreleri 6 ölüyor öncelikle ortaya çıkan epigenetik değiştirilmiş DNA fragmanları dolaşan ölçerek biyobelirtecin deneyleri geliştirdik. Bugüne kadar yayınlanan deneylerin tümünde, odak diğer hücre tiplerine göre kodlama ve yükseltici bölgelerinde metillenmemiş CpG bölgelerinin daha yüksek seviyede gösteren insan geni kodlayan prepro (INS) ölçülmesi olmuştur. Unmethylated INS DNA fragmanları kurtuluş (nekrotik, apoptotik) β hücreleri ölüyor öncelikle kaynaklanan olarak varsayılmıştır. Bizim son çalışmalar gençlik, pozisyon -69 bp metillenmemiş ve metile hem INS DNA'daki yükselmeler (göreceli t olduğunu gösterdiO yeni başlayan T1D gözlendi) sitesi başlatmak ve birlikte bu nüfus 6 gibi özel biyomarkerlar görev transkripsiyon bölgesinin. Bu biyomarker deneyler, izole edilmiş bir DNA bisülfit dönüştürülmesi takip ticari eğirme kitleri kullanılarak serum veya plazma hücre içermeyen DNA izolasyonu, içeren (urasillere olmayan metillenmiş sitosinler dönüştürmek için sağlam metillenmiş sitosinler bırakarak).
Bu yazıda farklı şekilde metillenmiş INS DNA serum örneği toplama, serumdan hücre içermeyen DNA, bisülfit dönüşüm ve (bundan böyle, dijital PCR) damlacık dijital PCR performansı izolasyonu teknik yönlerini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA methyltransferases tarafından sitozinler metilasyon birçok genin de transkripsiyon epigenetik kontrol sağlar. İnsanlarda INS gen neredeyse sadece hücrelerde β adacığın ifade ve onun transkripsiyon 11 susturmak için INS geninde sitozinlerin metilasyon sıklığı arasında bir ilişki olması görünür. 13 – Bunun gibi, çoğu hücre tipleri hücreler 11 ß göre çeşitli sitozinlerin de INS geninin metilasyon önemli ölçüde daha y?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
