Optogenetic यादृच्छिक mutagenesis में Histone-miniSOG का प्रयोग<em> सी। एलिगेंस</em
Summary
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग हिस्टोन-miniSOG एक नीली बत्ती पर निर्भर ढंग से जीनोम चौड़ा पैतृक म्यूटेशन लाती है। इस mutagenesis विधि सरल, तेज, जहरीले रसायनों से मुक्त है, और आगे आनुवंशिक स्क्रीनिंग और transgene एकीकरण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
Abstract
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Introduction
आगे आनुवंशिक स्क्रीन व्यापक रूप से इस तरह के Caenorhabditis एलिगेंस (एलिगेंस) 1 के रूप में मॉडल जीवों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में खलल न डालें आनुवंशिक म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ऐसे म्यूटेंट का विश्लेषण कार्यात्मक महत्वपूर्ण जीन की खोज करने के लिए नेतृत्व और उनके संकेत दे रास्ते 1,2। परंपरागत रूप से, सी में mutagenesis एलिगेंस mutagenic रसायन, विकिरण, या transposons 2 का उपयोग कर हासिल की है। ऐसे एथिल methanesulfonate (ईएमएस) और एन एन -ethyl- -nitrosourea (ENU) मनुष्य के लिए विषाक्त कर रहे हैं के रूप में रसायन; गामा-रे या पराबैंगनी (यूवी) विकिरण म्युटाजेनेसिस विशेष उपकरणों की आवश्यकता है; और इस तरह mutator उपभेदों 3, के रूप में transposon सक्रिय तनाव, रखरखाव के दौरान अनावश्यक म्यूटेशन पैदा कर सकता है। हम एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग photosensitizer 4 का उपयोग पैतृक म्यूटेशन प्रेरित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण विकसित किया है।
रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) डीएनए 5 नुकसान पहुंचा सकता है।मिनी स्वेटर ऑक्सीजन जनरेटर (miniSOG) 106 अमीनो एसिड होता है जो LOV (प्रकाश, ऑक्सीजन, और वोल्टेज) से इंजीनियर था Arabidopsis phototropin 2 से 6 के डोमेन का हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन होता है। नीले प्रकाश (~ 450 एनएम), miniSOG के लिए जोखिम पर आरओएस एक सहायक कारक 6-8, जो सभी कोशिकाओं में मौजूद है के रूप में फ्लोरिडा Avin mononucleotide साथ स्वेटर ऑक्सीजन सहित उत्पन्न करता है। हम हिस्टोन -72, एक सी सी टर्मिनस के लिए miniSOG टैगिंग से एक उनकी mSOG संलयन प्रोटीन का निर्माण Histone 3. की एलिगेंस संस्करण हम सी के germline में उनकी mSOG व्यक्त करने के लिए एक एकल कॉपी ट्रांस्जीन 9 उत्पन्न एलिगेंस। अंधेरे में सामान्य संस्कृति शर्तों के तहत, उनकी mSOG ट्रांसजेनिक कीड़े सामान्य चिंता आकार और जीवन काल 4 लोगों की है। नीले एलईडी प्रकाश के संपर्क करने पर, उनकी mSOG कीड़े उनके वंशज 4 के बीच पैतृक म्यूटेशन का उत्पादन। टी करने के लिए C: एक और जी: सी सी: जी, और छोटे chromoso प्रेरित म्यूटेशन के स्पेक्ट्रम ऐसे जी के रूप में न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन भी शामिल है,मेरे 4 विलोपन। इस mutagenesis प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और कम से कम प्रयोगशाला सुरक्षा सेटअप की आवश्यकता है। यहाँ, हम एलईडी रोशनी सेटअप और optogenetic mutagenesis के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम optogenetic mutagenesis की एक विस्तृत प्रक्रिया का उपयोग कर अपने-mSOG germline में व्यक्त किया है और एक छोटे पैमाने पर आगे आनुवंशिक स्क्रीन का एक उदाहरण प्रदान का वर्णन है। मानक रासायनिक उत्परिवर्तजनन की तुलना में, इ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Materials
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |
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