Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Genetik olarak kodlanmış histon miniSOG mavi ışığa bağımlı bir şekilde genom kalıtsal mutasyonlara neden olur. Bu mutajenez yöntemi, hızlı, basit toksik kimyasalların serbest ve ileri genetik tarama ve transgen entegrasyonu için çok uygundur.

Introduction

Ileri genetik ekranlar yaygın olarak Caenorhabditis elegans (C. elegans: 1) gibi model organizmaların çeşitli biyolojik süreçleri bozarak genetik mutantlarını üretmek için kullanılmıştır. Bu tür mutantlar analizleri işlevsel olarak önemli genlerin keşfi yol ve sinyalizasyon 1,2 yolaklarıyla. Geleneksel olarak, C. mutagenez elegans mutajenik kimyasallar, radyasyon, veya transpozonlar 2 kullanılarak elde edilir. Örneğin etil metansülfonat (EMS) ve N-etil-N -nitrosourea (TRK) insanlar için toksik olduğu gibi kimyasalları; gama ışını ya da ultraviyole (UV) radyasyon mutagenez özel ekipman gerektirir; ve Mutator suşları 3 gibi transpozon aktif suşları, bakım sırasında gereksiz mutasyonlara neden olabilir. Biz genetik olarak kodlanmış foto 4 kullanılarak kalıtsal mutasyonlar ikna etmek için basit bir yaklaşım geliştirdik.

Reaktif Oksijen Türleri (ROS) DNA 5 zarar verebilir.Mini Singlet Oksijen Jeneratörü (miniSOG) DL (Işık, Oksijen ve Voltaj) için tasarlanmış olan 106 amino asit Arabidopsis phototropin 2 6 etki bir yeşil floresan protein. Mavi ışık (~ 450 nm), miniSOG maruz kalma üzerine ROS bütün hücrelerde mevcut olan bir kofaktör 6-8 olarak fl avin mononükleotid singlet oksijen de dahil olmak üzere oluşturur. Bu histon-72, bir C, C-terminaline miniSOG etiketleyerek bir His-MSOG füzyon proteinini inşa Histon 3. elegans varyantı Bunun C tohum çizgisinden Onun-MSOG ifade etmek için bir tek kopya transgen 9 oluşturulan elegans. karanlıkta normal kültür koşulları altında, His-MSOG transgenik solucanlar, normal kuluçka büyüklüğü ve ömrü 4 var. Mavi LED ışığına maruz kalma üzerine, His-MSOG solucanlar soylarına 4 arasında kalıtsal mutasyonlara üretir. T: C: A ve G: C C: G ve küçük chromoso indüklenen mutasyon spektrumu, G gibi nükleotid değişiklikleri içerirBana 4 silmeleri. Bu mutagenez prosedürü gerçekleştirmek için basit ve minimal laboratuvar güvenliği kurulum gerektirir. Burada, optogenetic mutagenez için LED aydınlatma kurulum ve prosedürler açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LED Aydınlatıcı 1. İnşaat

NOT: Gerekli LED ekipman Malzeme Listesi'nde özetlenmiştir. Tüm LED kurulum küçük ve biz solucanlar 4 ışık pozlama kontrolü için karanlık bir odada yerleştirilmesi önerilir rağmen, laboratuarda herhangi bir yere yerleştirilebilir.

  1. Kablolar (Şekil 1A, D) ile bir denetleyiciye LED bağlayın.
  2. Bir BNC kablosu (Şekil 1A, C, D) ile bir dijital fonksiyon jeneratörü / amplifikatör kontrolörü bağlayın.
  3. Özel bir tutucu (Şekil 1A) kullanarak aşamada yukarıda LED ışık 10 cm düzeltildi.
    NOT: Biz metal parçalar ile tutucu yaptı.
  4. Kısmen LED aydınlatma kurulum Kapak, ancak solucanlar hasta ediyor ısı birikimini (Şekil 1B), kaçının.
    NOT: Açık Üst ve alt (Şekil 1A) ile bir ısmarlama sert plastik kapak kullanın. Kapak mutagenez kendisi için gerekli değildir, ancak t kullanılano çevreye mavi ışık gereksiz maruz kalma sınırı. Biz solucan aşırı ısınmasını önlemek için LED kurulumu tamamen (Şekil 1B) kapsamaz tavsiye ederiz.
  5. lazer koruyucu gözlük kullanın.
    NOT: Işık çok parlak olduğu için biz lazer koruyucu gözlük. Güneş de çalışabilir.
  6. LED kontrolör kolu Anahtarı 'Int.' ve sürekli aydınlatma (Şekil 1D) için maksimum güç (Şekil 1C)% 65 olarak ayarlayın.
  7. solucanlar üreticinin protokolü kullanılarak yerleştirilir sahnede mavi ışık yoğunluğunu ölçmek için bir fotometre kullanın. Kurulum sürekli aydınlatma altında 2.0 mW / mm 2 verir.

2. Mavi Işık Tedavisi

NOT:. [CB-unc-119 (+) Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) +] unc-119 (ED3) III 4 streyn mevcuttur suşu CZ20310 juSi164 kullanın Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC de http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. E. standart nematod büyüme ortamı (NGM) karanlıkta His-MSOG gerginlik korumak plakalar E. coli OP50 standart bir protokol 10,11 aşağıdaki.
    NOT: Ortam ışığı altında, juSi164 ihtiva-eden suşlar kendiliğinden oranı 4 üzerinde bir mutasyon oranını görüntüler yok. genellikle de mutasyona neden olmayan bir halojen lamba ile bir diseksiyon kapsamı kullanarak rutin zorlanma geçit. Bununla birlikte, bakım standart karanlık iç inkübatör suşları tutmak veya folyo ile suşları kapsayan, örneğin ışığa maruz kalmasını gereksiz önlemek için alınmalıdır. Gereksiz mutasyonlar zamanla birikir durumda aldıktan sonra zorlanma hacimde dondurmak için tavsiye edilir.
  2. Gebe genç yetişkin almak bir solucan (yaklaşık 12 saat sonrası L4) hayvanlar 11 seçin.
    NOT: Büyük hayvanların düşük kuluçka boyutuna sahip olurken genç hayvanlar, daha az mutajenik etkisi 4 göstermektedir.
  3. Bir filtre p Cutaper 25 mm x 25 mm kare delik olan 60 mm plaka uyacak ve bir dereceye giremeyen plaka (Şekil 1E) üzerine yerleştirin.
    NOT: Bir kare zımba kullanılabilir, ancak bu zımbanın büyüklüğüne hassas olması gerekmez.
  4. Plaka üzerinde kare deliğin içindeki solucanlar kısıtlamak için eşit filtre kağıdı üzerinde 100 mM CuCl 2 100 mcL bırakın.
  5. Gebe genç yetişkin çift cinsiyetli istenilen sayıda (bir örnek için Adım 3) almak ve CuCl 2 plakanın merkezine transfer.
  6. Lazer koruyucu gözlük kullanın.
  7. LED ve fonksiyon jeneratörü AÇIN.
  8. LED kontrolör kolu Anahtarı 'Ext.' fonksiyon üreteci (Şekil 1D) tarafından kontrol etmek.
  9. Maksimum güç% 65 denetleyicisi ve sinüs dalga 4 Hz (Şekil 1C) olarak işlev jeneratör ayarlayın.
  10. LED (Şekil 1A <altında sahnede bir kapaksız Adım 2.5 den CuCl 2 tabak yerleştirin/ Strong> ').
  11. 30 dakika boyunca mavi ışıkla hayvanları aydınlatır.
  12. P 0 olarak seribaşı plaka sağlıklı görünen solucanlar aktarın.
    NOT: P 0 istenen numarası ekranın türüne bağlıdır. Örnek için Adım 3'e bakın. P 0 solucanlar ışık tedavisi hemen sonra koordinasyonsuzluk görünebilir ve zamanla iyileşir.
  13. bir kuluçka veya karanlık folyo kullanarak kapalı solucanlar tutun; ve onların döl 2,10 arasında istenen fenotipleri tarama başlamak için standart prosedürü izleyin.

Bir İleri Genetik Ekran 3. Örnek

Not:. Bu LED ve zorlanma çalışma olup olmadığını kontrol etmek 120 haploid genomlar ile klonal ekranın bir örneği Şekil 2 prosedürün şemasını göstermektedir.

  1. [Day1] mavi ışık tedavisinden sonra, P 0 olarak OP50 ile NGM plaka üzerine beş sağlıklı görünümlü solucanlar almak 20 ° C inkübatör tutmak ve bunları 1 için yumurtalarını izind ( 'DAY1' plaka).
  2. [Day2] Yeni numaralı seribaşı plaka üzerine Transferi P 0 ( 'DAY2' plaka).
  3. [Day3] seçin ve yakarak 'DAY2' plaka üzerinde P 0 öldürmek.
  4. [Day4] 'DAY1' plaka 30 gebe genç erişkin F 1 Pick up ve bireysel plakalar ( 'DAY1' için 30 F 1 tabak) üzerine aktarabilirsiniz.
  5. 'DAY2' plaka için [Day5] Adımı tekrarlayın 3.4 ( 'Day2' için 30 F 1 tabak).
  6. Onlar yetişkin olunca [Day7-9] standart stereomikroskop altında anormal morfolojiye ve / veya WT suşu (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında F 2 solucanlar davranışını kontrol edin.
    NOT: yüksek penetrans ile resesif F 2 arasında aynı fenotipe sahip solucanlar yaklaşık dörtte bir kalıtsal mutasyon görüntülenir. Bununla birlikte, bazı mutantlar yavaş büyür ve / veya kısmi bir penetrans gösterebilir. Nedenle, mutantların az dörtte bir bulunabilir olması mümkündürplaka.
  7. ayrı ayrı görünür fenotipleri ile solucanlar almak ve gelecek nesil fenotip kalıtım kontrol edin.

bir kromozom dışı transgen entegrasyon 4. Örnek

  1. Bir sahip CZ20310 juSi164 ilgi konusu DNA'yı enjekte [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) hazırlamak transgenik solucanlar standart bir enjeksiyon protokolü 12,13 aşağıdaki düşük iletim hızı (% 10-30).
    NOT: Alternatif olarak, kurulan ekstrakromozomal diziler juSi164 suşları içine geçilebilir. JuSi164 için genotipleme önlemek için, juSi164 heterozigot etkinliği azalmış olabilir, ancak P 0 olarak kullanılabilir. JuSi164 için genotipleme yöntemi Bölüm 5'te tarif edilmektedir.
  2. Aşama 2'de tarif edildiği gibi [Day1] ~, mavi ışık ile P 0 20 olarak transgenik hayvanların tedavi edin.
    NOT: Daha fazla P 0 solucanlar tr bağlı olarak gerekli olan ansmission oranı. Transgenlerin fenotipleri veya ko-enjeksiyon işaretleyici 12,13 ile tespit edilebilir.
  3. Bireysel plakalar üzerine 10 sağlıklı görünümlü P 0 pick 20 ° C inkübatör tutmak ve onları bir kaç gün (P 0 plakaları) için yumurtalarını izin
  4. [Day4] Tek: 20 transgenik F 1 bireysel plakalar üzerine her P 0 plaka solucanlar ve onları yumurtalarını edelim. (20 F 1 x 10 P 0 tabak = toplam 200 F 1 tabak.)
  5. [Day7] F>% 75 F 2 olan transgenlerin 1 tabak bulun.
  6. F>% 75 iletim hızı 1 tabak (F 2 tabak), beş transgenik hayvanlar seçin.
  7. [Day10] F potansiyel entegre çizgiler olarak% 100 iletim hızı ile 2 tabak tutun.
  8. Mendel ayrımını kontrol etmek ve potansiyel arka plan mutasyonları kaldırmak için standart bir prosedür 10 kullanılarak potansiyel entegre çizgiler outcross.
le "> 5. Genotiplendirme

  1. Lyse 20 standart bir protokol 14 kullanılarak lizis tamponu F 2 solucanlar outcrossed.
  2. Standart bir protokol 14 Aşağıdaki 58 ° C'lik bir tavlama sıcaklığı ile MosSCI yerleştirilmesi 9 juSi164 (Tablo 1) primerleri kullanılarak PCR gerçekleştirin.
    NOT: unc-119 (ED3) Aşağıdaki Adımlar 5.4 ve 5.5 tahlisiye transgen (juSi164) çıkardıktan sonra koordinasyonsuzluk davranış tarafından tespit edilebilir, çünkü unc-119 (ED3) genotipinin gereksizdir.
  3. Agaroz jel elektroforezi 15 çalıştırın ve juSi164 için WT bulmak için bant boyutları (Tablo 1) inceleyin.
  4. F 2 döl nedeniyle unc-119 (ED3) varlığına solucanlar felç olup olmadığını inceleyin.
  5. koordinasyonsuzluk solucanlar adım 5.4 bulunursa, tek birkaç nonuncoordinated solucanlar nesil tüm nonuncoordinated solucanlar elde etmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz 120 Mutagenezli haploid genomlar karşılık gelen 60 F 1 tabak arasında Bölüm 2 ve 3'te açıklanan standart protokol izlenerek 30 dakika ışığa maruz kullanarak CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) ile bir ileri genetik ekran gerçekleştirilen biz 8 F 1 tabak bulundu F vücut büyüklüğü defekt (Şekil 3B), koordinasyonsuzluk hareketi (Şekil 3C), ve yetişkin öldürücülüğü (Şekil 3D) olarak görünür fenotipleri görüntüleme 2 solucanlar. Biz 'DAY1' ve 'DAY2' levhalar arasındaki mutantlar sayısında herhangi bir fark etmedi. Saydı küçük F 2 solucanlar ve koordinasyonsuzluk F 2 solucanlar tüm döl onlar kalıtımsal mutantlar olduğunu öne sürerek, mukabil fenotipleri gösterdi. Tam bir gözlem Tablo 2'de özetlenmiştir. Ortalama olarak, 120 haploid genomlar ile klonal ekranı 10 F 1 plakaları neden olur conKolayca bir stereo mikroskop altında tespit vücut şekli ve hareket olarak gözle görülür saptanabilir fenotip ile solucanlar taining. Daha nicel analizi mutasyon oranını tam olarak 4 belirlenmesi gereklidir. Bu ekranda görünür mutantlar beklenen sayısı suşu ve kurulum optogenetic mutasyon için düzgün çalışıyor olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1:. LED Kur (A) Bütün sistem. LED ısmarlama tutucuya monte edilmiştir. Ayrıntılar Malzeme Listesi'nde bulunur. (B) kapağı plastikten yapılır. Bu ısı birikimini önlemek için sistemi tam olarak kapsamaz. (C) Kontrol ve işlev üreteci. (D) Sistemin arka tarafında. (E) mavi ışık tedavisi için CuCl 2 -soaked filtre kağıdı ile bir dereceye giremeyen plaka. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: a. Klonal Ekran için Deneysel Yöntem mavi ışık tedavisinden sonra, P 0 solucanlar bir numaralı seribaşı plakaya aktarılır ve yumurtalarını bırakmak için izin verilir. P 0 solucanlar ışık tedavisinden sonra yeni bir numaralı seribaşı plaka 1 d transfer ve hafif tedaviden sonra 2 d öldürüldü. F 1 solucanlar P 0 plakalardan saydı edilir. F 2 solucanlar Fenotipleri yetişkin olduklarında sonra incelenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

10fig3.jpg "/>
Şekil 3: Mutants Örneği optogenetic mutagenez için (A) Orijinal suşu:. CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3). Bu gerginlik normal vücut şekli, davranışları, ve kuluçka boyutu vardır. Ölçek çubuğu: 0.5 mm. . (B - D) F 2 döl gösteren vücut büyüklüğü kusur (B), koordinasyonsuzluk (C), ve öldürücü (D) fenotipi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tablo 1
Tablo 1: juSi164 ve unc-119 (ED3) ve Genotiplendirme.

Tablo 2
Tablo 2: Fenotipleri fr ÖrneğiBir Klon Ekranı om.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, Optogenetic mutagenez ayrıntılı bir prosedür His-MSOG germline ifade ile ve küçük ölçekli bir ileri genetik ekranının bir örneğini sağlar tarif eder. standart kimyasal mutajenezi ile karşılaştırıldığında, bu Optogenetic mutajenez yöntemi, bir çok avantaja sahiptir. Öncelikle, bu sayede uzak gibi EMS, TRK gibi toksik kimyasal mutajen gelen laboratuar personelinin tutmak ve ultraviyole ışık (TMP / UV) ile Trimethylpsoralen, zehirsizdir. İkinci olarak, mutagenez deney prosedürü, p 0 hayvan az sayıda kullanılabilir ve bir saat içinde bitirilebilir. Üçüncü olarak, Optogenetic mutagenez nükleotid ikameleri ve kromozom anormallikleri dahil olmak üzere, mutasyon, geniş bir spektrum oluşturur. Son olarak, Optogenetic mutagenez ekstrakromozomal transgenlerin entegrasyonu için kullanılabilir.

Bu mutagenez protokol kritik adım LED kurulum ex His-MSOG içeren suşlar üzerinde çalıştığından emin olmak içinnen verim. yaklaşık 100 haploid genomlar ile Protokol Bölüm 3'te açıklanan gibi bir pilot klonal ekran yapılmasını öneriyoruz. Mutagenez ışık tedavisi için P 0 sayısını artırarak nonclonal ekranlara küçük ölçekli pilot ekranlarından kolayca ölçeklenebilir. Büyük ölçekli nonclonal ekranlar için, gebe genç yetişkinlerin solucanlar senkronize öneririz ve ışık tedavisi için CuCl 2 plaka üzerine M9 çözümü ile bunların yüzlerce aktarılması. Standart durum Adımlar 2'de tarif ve 3 yaygın olarak kullanılan 50 mM EMS mutagenez yöntemiyle 4'ten yaklaşık 4,4 kat daha düşük verim sahip olduğu tahmin edilmektedir. Mutasyon oranı, ışığa maruz kalma süresini arttırmak ve / veya ışık yoğunluğunu arttırarak geliştirilebilir. Bununla birlikte, bu modifikasyonların fototoksisite neden olabilir ve açık tedavi solucan küçük kuluçka boyutu ve hastalık yol açabilir. etkinliğini arttırmak için, daha yüksek TSH verimi, bu tür ile miniSOG türevlerini kullanmak mümkün olabilirminiSOG (Q103L) ışık tedavisi 16,17 olmadan arka plan mutagenez etkilerini artırabilir olsa da. DNA yapısının modifikasyonu için, Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) plazmid (pCZ886) ticari olarak temin edilebilir.

% 30 - 10 arasında bir sıkıştırma oranına sahip bir ekstra transjenik soy kullanıldığında burada tarif edilen koşullar altında, entegre transgenler, ortalama 4 200 F 1 'e göre yaklaşık olarak bir hat oluşturulur. Bu etkinlik, daha önce, bir UV ışını yöntemi 18 için belirtilen yüksek aktarım oranına sahip ekstrakromozomal transjenik türleri kullanılarak arttırılabilir.

His-MSOG aracılı Optogenetic mutagenez gen geniş bir mutasyon neden olur. Ayrıca, optogenetic mutagenez kullanarak rpm-1 baskılayıcı ekranından kurtarıldı loci sıklığı EMS 4 kullanarak aynı ekrandan olanlara benzer. Bununla birlikte, Possi olduğunedeniyle böyle bir kromatin yapısı olarak bilinmeyen faktörler, bazı genlerin karşı bir önyargı olabilir, bir histon gen kullanarak bu optogenetic mutagenezi ble. Bu sorunu çözmek için, tüm genom dizileme birçok optogenetically uyarılan mutasyonların analiz etmek gerekmektedir.

His-MSOG aracılı Optogenetic mutagenez, tek nükleotid ikameleri, 1 bp birkaç yüz bp'lik 4 arasında değişen silme de dahil olmak üzere mutasyon, geniş bir spektrum neden olur. Tek nükleotid varyantlarının spektrumu miniSOG-reaktif oksijen türlerinin, mutasyon 4 neden olduğunu göstermektedir. MiniSOG proteinleri hem de 19 etkisiz hale getirmek için kullanılır, çünkü miniSOG zarar proteinleri sübstrat olarak histon ve kromatin kararsızlığına neden olur olması da mümkündür. Farklı yoğunluklarda ışık kullanılarak mutasyon tipini değiştirmek mümkün olabilir. optogenetic mutajenez silmeleri neden olduğundan, silmeler yanı sıra tek nükleotid değişiklikleri analiz etmek önemlidireşleme 20 le genom sekanslama verileri.

Daha önce, bir epifluorescent mikroskobu miniSOG aracılı hücre ablasyon 21,22 için kullanıldığı da rapor edilmiştir. Standart bir epifluorescent bileşik mikroskop ışık yoğunluğu, standart Optogenetic mutagenez protokolünde kullanılan yaklaşık 4 kat daha düşük olan bir lens olmaksızın ~ 0.5 mW / mm2 olarak ölçülür. Durumda, bir ışık kaynağı olarak bir epi-floresan mikroskop kullanarak deneysel olarak etkinliğini belirlemek için yüksek ölçüde tavsiye edilir. LED bir avantajı binlerce saatlik üzerinde istikrardır. Daha önceki çalışmalar, kesin mekanizması henüz belirlenmemiştir, ancak miniSOG, darbeli ışık 22 altında ROS aracılı hücre ablasyon daha kuvvetli olduğunu göstermiştir. Biz darbeli ışık yapmak için bir dijital fonksiyon jeneratörü / amplifikatör kullanıldı. Başka bir seçenek LED li düzenleyen bir USB-TTL arayüzü (Şekil 1A) kullanarak bir bilgisayara ışık kaynağını bağlamak içinBir program tarafından GHT. Burada tarif edilen LED sistemi aynı zamanda channelrhodopsin 23 kullanılarak uyarılabilir hücrelerin Optogenetic kontrolü gibi diğer amaçlar için kullanılabilir bölgesinin hücre ablasyon mitochondria- veya hücre membranını hedefli miniSOG 17,22 kullanılarak ve Hafif inaktivasyon (Cali) Kromofor Destekli proteinler 19. Ayrıca, bu Optogenetic mutagenez, bakteri, maya, sinek ve zebra balığı gibi diğer organizmalar, ve aynı zamanda, memeli hücre çizgileri uygulanacak bir potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868 (2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271 (2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316 (2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

Tags

Genetik Sayı 117 genom rastgele mutagenez DNA modifikasyonu ROS histon-miniSOG transgen entegrasyonu kromozomal silme ileri genetik tarama
Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random … More

Noma, K., Jin, Y. Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans. J. Vis. Exp. (117), e54810, doi:10.3791/54810 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter