Preparación de rAAV9 que sobreexpresan o una caída en los genes de ratón Corazones
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
El control de la expresión o actividad de genes específicos a través de la entrega de miocardio de los materiales genéticos en modelos murinos permite la investigación de las funciones de genes. Su potencial terapéutico en el corazón también se puede determinar. Hay enfoques limitados para la intervención molecular in vivo en el corazón del ratón. Virus adeno-asociado (rAAV) basada en la ingeniería del genoma recombinante se ha utilizado como una herramienta esencial para la manipulación genética cardiaca in vivo. Las ventajas específicas de esta tecnología incluyen una alta eficiencia, alta especificidad, porcentajes de integración genómica baja, mínimo inmunogenicidad y patogenicidad mínima. A continuación, se describe un procedimiento detallado para construir, empaquetar y purificar los vectores rAAV9. La inyección subcutánea de rAAV9 en cachorros neonatales como resultado la expresión robusta o knockdown eficaz del gen (s) de interés en el corazón de ratón, pero no en el hígado y otros tejidos. Uso de la cardiaca específiSe obtuvo c TNNT2 promotor, la alta expresión de gen GFP en el corazón. Además, ARNm objetivo se inhibió en el corazón cuando se utilizó un rAAV9-U6-shRNA. Trabajando conocimiento de la tecnología rAAV9 puede ser útil para investigaciones cardiovasculares.
Introduction
El control de la expresión o actividad de genes específicos en diversos sistemas biológicos se ha convertido en una estrategia valiosa en el estudio de la función del gen 1. Un medio directo de lograr este objetivo es manipular secuencias de nucleótidos y generar alelos mutantes. A pesar de hacer cambios precisos, dirigidas al genoma de las células vivas es todavía un tiempo y la práctica intensiva en trabajo, el desarrollo de las poderosas herramientas y TALEN CRISPR / Cas9 ha abierto una nueva era de la edición genoma 2-5. Un método de laboratorio más habitual para la manipulación genética se ha centrado en la introducción de material genético (ADN y ARN que contienen secuencias codificadoras o siRNAs / shRNAs) en las células para expresar el gen o desmontables (s) de interés 1,6.
En muchos casos, el principal cuello de botella para la manipulación genética es la entrega de ADN, ARN, o proteína en las células. Con respecto a los estudios in vitro, transfecti eficienteen los sistemas se han establecido en muchas líneas celulares cultivadas. Sin embargo, en el modelo de ratón, en particular, la entrega de genes in vivo en es más difícil. Hay una serie de barreras extra e intracelulares que necesitan ser pasado por alto con el fin de lograr la captación celular eficiente de los reactivos exógenos. Otros obstáculos incluyen la rápida eliminación y la corta duración del 7,8 entregado materiales. Una estrategia para evitar estos problemas es el uso de vectores virales como "portadores" o "vehículos" para la entrega de genes in vivo. Las propiedades de transducción evolucionado natural de los virus permiten la prestación eficiente de un gen de interés en células 7,9,10. Numerosos tipos de vectores virales se han desarrollado y permitir flexibilidad en la manipulación de genes in vivo en diferentes tipos de células y órganos en ratones.
Los sistemas virales más comúnmente usados incluyen Retrovirus, Lentivirus, adenovirus y virus adeno-asociado (AAV) <shasta> 11. Los retrovirus son virus de ARN de cadena simple y se puede introducir su material genético al genoma de la célula huésped de una manera estable durante la división mitótica, proporcionando el potencial para la expresión de toda la vida de los genes transducidos en las células diana y órganos 12-14. Sin embargo, muchos tipos de retrovirus infectan solamente las células en división, y su eficacia en las células que no se dividen es muy baja 15. Esto limita su utilidad para la administración de genes. Lentivirus es un género de la familia Retroviridae. A diferencia de otros retrovirus, lentivirus puede infectar tanto a células que se dividen y que no se dividen y se ha utilizado ampliamente para la transferencia génica en post-mitótico y células diferenciadas altamente-16. El ciclo de vida de Lentivirus también implica la integración de ADN del vector en el genoma huésped. Por lo tanto el suministro de genes, Lentivirus mediada permite la expresión estable y de larga duración de los elementos genéticos transducidas 16-18. Sin embargo, esta función puede representar un doble-eespada DGED en el uso de estos virus para manipular la expresión génica, como la integración de ADN del vector puede dar lugar a la mutagénesis de inserción en las células huésped y puede causar efectos artefactual. Adenovirus es otro sistema de administración de genes ampliamente utilizado. A diferencia de los retrovirus y lentivirus, adenovirus son no integradas y no interfieren con la integridad genómica de las células huésped 8,10,11,19. Además, los adenovirus puede transfectar ADN en muchos tipos de células, y la infección no depende de la división celular activa 19. Otra característica importante de los adenovirus es la facilidad de purificación de vector, como los vectores virales tienen la capacidad de replicarse 19,20. Sin embargo, la principal advertencia de este sistema es que la infección por adenovirus puede desencadenar respuestas inmunes fuertes en las células diana y los órganos 19, restringiendo su uso en muchas investigaciones, en particular en los estudios de terapia génica.
En comparación con este tipo diferentes de vectores virales, virus asociado a adeno recombinante (rAAV) parece ser el sistema de suministro de genes ideales 21,22. Exhibe inmunogenicidad y patogenicidad 23,24 mínima. Además, rAAV infecta a una amplia gama de tipos de células, incluyendo tanto las células que no se dividen y divisoria. En la mayoría de los casos, rAAV no se integra en el genoma de acogida; por lo tanto, el riesgo de cambios genéticos o genómicos no deseados en las células diana es baja 22.
Recientemente, los sistemas de rAAV se han utilizado con éxito para la entrega in vivo de ADN que codifica proteínas, miRNAs, shRNAs, y CRISPR-gRNAs en ratón músculo cardíaco 23,25-29. Esta metodología ha facilitado las investigaciones fundamentales y los estudios de terapia génica en el campo de la investigación cardiovascular. Aquí, el procedimiento detallado para generar vectores rAAV9 que sobreexpresan de manera eficiente o desmontables los genes de interés en los corazones de ratón se ha descrito. El protocolo proporciona un método simple y eficaz dela manipulación de la expresión génica cardiaca en modelos experimentales murinos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es importante minimizar la recombinación ITR no deseado durante la construcción del plásmido. Antes de generar el virus, hay que vigilar siempre la integridad de los plásmidos ITR de AAV mediante digestión de restricción y electroforesis en gel de agarosa. Es imposible obtener 100% plásmidos intactos, pero la relación de recombinación debe minimizarse tanto como sea posible. Menos de 20% es aceptable para el envasado rAAV9 éxito. Es de destacar que el cultivo de las bacterias a menor temperatura (30 ° C) con …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
References
- Primrose, S. B., Twyman, R. . Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
- Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).
- Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
- Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
- De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
- Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
- Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
- Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
- Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
- Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
- Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
- Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
- Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
- Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
- Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
- Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
- Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
- Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
- Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
- Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
- Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
- Piras, B. A., O’Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894 (2013).
- Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).
