마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
뮤린 모델에서 유전 물질의 전달을 통해 심근 발현 또는 특정 유전자의 활성을 조절하는 유전자 기능의 조사를 허용한다. 마음에 그들의 치료 가능성도 결정될 수있다. 마우스 마음에 생체 분자의 개입에 대한 제한된 접근 방법이있다. 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV) 기반 게놈 엔지니어링은 생체 내 심장 유전자 조작을위한 필수적인 도구로 활용되고있다. 이 기술의 구체적인 장점은 최소한의 높은 효율, 특이성, 낮은 게놈 통합 레이트를 포함 면역 원성, 최소한의 병원성. 여기서, rAAV9 벡터를 구성하는 패키지와 정화 상세한 절차를 설명한다. 신생아 새끼로 rAAV9의 피하 주사는 간 및 기타 조직에서 강력한 발현 또는 마우스 심장에 대한 관심의 유전자 (들)의 효율적인 최저의 결과가 아니라. 심장-보고 특정 사용C TnnT2 프로모터, 마음에 GFP 유전자의 고 발현을 얻었다. 또한, rAAV9-U6-shRNA를가 이용 될 때의 mRNA가 마음에 억제 대상. rAAV9 기술의 지식을 작업 심장 혈관 연구에 유용 할 수있다.
Introduction
다양한 생물학적 시스템에서 특정 유전자의 발현 또는 활성을 제어하는 유전자 기능 (1)의 연구에 귀중한 전략이되고있다. 이러한 목적을 달성하는 직접적인 방법은 뉴클레오티드 서열을 조작하여 돌연변이 대립 유전자를 생성한다. 살아있는 세포의 게놈에 정확한 타겟 변경하는 것은있을지라도 a는 시간과 노동 집약적 인 연습, 강력한 TALEN 및 Crispr / Cas9 도구의 개발은 게놈 편집 2-5의 새로운 시대를 열었습니다. 유전자 조작보다 일상적인 실험 방법은 유전 물질 (DNA를 코딩 서열 또는 siRNA를 / shRNA를 포함하는 RNA를) 명시 적 또는 관심 1,6의 유전자 (들)를 넉다운 할 수있는 세포로을의 도입에 초점을 맞추고있다.
많은 경우에, 유전자 조작을위한 주요 병목 세포 내로 DNA, RNA 또는 단백질의 전달이다. 시험관 연구와 관련, 효율적인 transfecti로시스템에 많은 배양 세포 라인에 설립되었습니다. 그러나, 특히 마우스 모델에서 생체 내 유전자 전달은 더 도전이다. 외인성 시약의 효율적인 세포 흡수를 달성하기 위하여 바이 패스 될 필요 역외 세포 내 장벽의 시리즈가있다. 추가 장애물은 신속한 통관 및 전달 물질의 7,8의 짧은 기간을 포함한다. 이러한 문제를 회피하기위한 한 가지 전략은 생체 내 유전자 전달에 대한 "캐리어"또는 "차량"으로 바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 바이러스의 자연적 진화 전달 특성은 세포 7,9,10에 관심있는 유전자의 효율적인 전달을 할 수 있습니다. 바이러스 벡터의 많은 종류가 개발 마우스에서 다른 유형의 세포 및 기관의 생체 내 유전자 조작 유연한 사용되었다.
가장 일반적으로 사용되는 바이러스 시스템은 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 아데노 바이러스 및 아데노 – 관련 바이러스 (AAV)를 포함 <s> 11입니다. 레트로 바이러스는 단일 가닥 RNA 바이러스이며 표적 세포 및 기관 12-14에서 형질 도입 유전자의 평생 발현의 가능성을 제공하고, 유사 분열 분할 중에 안정한 방식으로 숙주 세포의 게놈에 유전 물질을 도입 할 수있다. 그러나, 레트로 바이러스의 여러 유형의 세포만을 분할 감염, 비 – 분할 세포의 효능 15 매우 낮다. 이 유전자 전달을 위해 자신의 유틸리티를 제한합니다. 렌티 바이러스는 Retroviridae 가족의 속입니다. 다른 레트로 바이러스와는 달리, 렌티 바이러스 모두 분할 및 비 – 분할 세포를 감염시킬 수있는 널리 포스트 유사 분열 및 고도로 분화 된 세포 (16)에 유전자 전달을 위해 사용되었다. 렌티 바이러스의 생활주기는 숙주 게놈 내로 벡터 DNA의 통합을 포함한다. 따라서,의 Lentivirus이 매개 유전자 전달은 형질 유전 적 요소 16-18의 안정적이고 오래 지속 표현을 할 수 있습니다. 그러나이 기능은 이중 전자를 나타낼 수있다벡터 DNA의 통합 삽입 성 돌연변이를 초래할 수있다 이러한 바이러스의 사용 dged 검, 유전자 발현을 조작 할 및 숙주 세포에 artefactual 효과를 일으킬 수 있습니다. 아데노 다른 널리 사용되는 유전자 전달 시스템이다. 레트로 바이러스 및 렌티 바이러스와는 달리, 아데노 바이러스는 비 통합하고 숙주 세포의 게놈 8,10,11,19 무결성을 방해하지 않는다. 또한, 아데노 바이러스는 많은 종류의 세포로 DNA를 형질 감염 할 수 있으며, 감염 활성 세포 분열 (19)에 의존하지 않다. 바이러스 벡터의 능력 (19, 20)를 복제 할 필요 같이 아데노 바이러스의 또 다른 중요한 특징은, 벡터 정제의 용이성이다. 그러나, 이러한 시스템의 주요주의 할 점은 아데노 바이러스 감염, 특히 유전자 치료 연구에서, 여러 연구에서의 사용을 제한하는 대상 세포 및 기관 (19)의 강한 면역 반응을 유발할 수 있다는 것이다.
서로 다른 유형에 비해바이러스 벡터들, 재조합 아데노 – 관련 바이러스 (rAAV)는 이상적인 유전자 전달 시스템 (21, 22)로 나타난다. 그것은 최소한의 면역 원성 및 병원성 (23, 24)을 나타낸다. 또한 rAAV는 핵공 포함한 세포 유형의 넓은 범위를 감염시킨다. 대부분의 경우, rAAV가 숙주 게놈에 통합되지 않는다; 따라서, 표적 세포의 바람직하지 않은 유전자 또는 게놈 변화의 위험이 낮은 (22)이다.
최근 rAAV 시스템 성공적 쥐 심근 23,25-29 DNA로 인코딩 단백질의 miRNAs, shRNA를하고 Crispr-gRNAs의 생체 내 전달을 위해 사용되었다. 이 방법론은 심혈관 연구 분야의 기초 연구 및 유전자 치료 연구를 촉진했다. 여기서, 자세한 절차는 효율적으로 기술되었다 과발현 또는 마우스 마음에 대한 관심의 유전자를 녹다운 rAAV9 벡터를 생성한다. 프로토콜은 간단하고 효과적인 방법을 제공한다실험 쥐 모델에서 심장 유전자 발현을 조작.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 플라스미드를 구조 중에 원하지 ITR 재결합을 최소화하는 것이 중요하다. 바이러스를 생성하기 전에, 하나는 항상 제한 분해 및 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 플라스미드 AAV ITR의 무결성을 모니터링한다. 이는 100 % 그대로 플라스미드를 획득하는 것은 불가능하지만, 재결합 율은 가급적 최소화되어야한다. 20 % 미만에 성공 rAAV9 포장 허용됩니다. 참고로, 저급 진탕 속도 (RPM 180-200)와 하부 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
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