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유전학

Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

Published: October 29, 2016
doi:
10.3791/54752
, , , , , ,
1Terrestrial Biofilms Group, Institute of Microbiology,Friedrich Schiller University, Jena

Summary

El papel de surtido (segregación espacial) en escenarios de evolución puede ser examinada usando sistemas microbianos simples en el laboratorio que permiten el ajuste de la distribución espacial controlada. Mediante la modificación de la densidad celular fundador, varios niveles de surtido pueden ser visualizados utilizando cepas bacterianas marcadas con fluorescencia en las biopelículas de colonias de Bacillus subtilis.

Abstract

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.

Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

Introduction

En las últimas décadas, los microbios han sido reconocidos como comunidades sociales asociados con diversos ecosistemas en la tierra 1,2. En contraste con las culturas planctónicos utilizados en la práctica de laboratorio en general, los microbios en el medio ambiente muestran una amplia gama de estructuras espaciales de la comunidad en función del entorno ecológico. Sistemas microbianos simples pueden ser utilizados para comprender la consecuencia de estructuras espaciales de la evolución de las interacciones sociales 3,4. Publicaciones de los últimos 2-3 años utilizando ambos sistemas modelo eucariotas y procariotas destacaron el impacto de las estructuras espaciales de la estabilidad de la cooperación dentro de las poblaciones microbianas 5-8. Además, obligar a las interacciones entre los microbios, por ejemplo, alimentación cruzada metabólico, también podría alterar la distribución espacial de socios que interactúan 9-11. La influencia de la estructura espacial en estos estudios se examina sobre todo el uso de células sésiles adjunta de superficie que habitan en el modoLos llamados biofilms o en colonias que crecen en la superficie de un medio de agar. La deriva genética resulta en una alta variedad espacial se puede observar en las colonias microbianas en el agotamiento de los nutrientes en el borde de un resultado de dilatación mediada por la división celular en la serie de cuellos de botella genético que causa la alta probabilidad de fijación local para ciertos linajes clonales 12. La deriva genética puede, por tanto, emplearse para examinar el papel de la segregación espacial en colonias microbianas.

En el medio ambiente, los biofilms son comunidades de especies múltiples rodeados de matriz polimérica de producción propia 13. Estructura de la biopelícula, la función y la estabilidad dependen de una red compleja de interacciones sociales donde las señales de cambio de bacterias, componentes y recursos de la matriz, o competir por el espacio y nutrientes utilizando toxinas y antibióticos. Bacillus subtilis es un suelo de vivienda y bacteria root-colonizar que desarrolla muy organizada comunidades del biofilm 14. En analogía a lo socialinsectos, B. subtilis células emplean una división de la estrategia de trabajo, el desarrollo de subpoblaciones de productores de la matriz extracelular y caníbales, células móviles, esporas inactivas y otros tipos celulares 15,16. El proceso de diferenciación es dinámico y puede ser alterada por las condiciones ambientales 17,18.

Estrategias de colonización superficie de las bacterias pueden ser fácilmente manipulados en condiciones de laboratorio mediante la modificación de la concentración de agar en el medio de crecimiento. A bajos niveles de agar (0,2-0,3%), las bacterias que albergan flagelos activo son capaces de nadar, mientras que el agar semisólido (0,7-1% de agar) facilita el flagelo impulsado por la comunidad difusión, llamado enjambre 19-21. En ausencia de flagelo, ciertas cepas bacterianas son capaces de moverse a través de medio semisólido a través de deslizamiento, es decir, el crecimiento de expansión de la población dependiente facilitado por matriz de exopolisacáridos y otros compuestos de hidrofobina secretadas 22-24. Finalmente, las bacterias que son capable forma de desarrollo de la biopelícula colonias estructuralmente complejas en medio de agar duro (1.2-2%) 14,17,25. Si bien estos rasgos se examinan en el laboratorio con un ajuste preciso de las condiciones, en los hábitats naturales de estas estrategias de dispersión de superficie podrían tránsito gradual de uno a otro dependiendo de las condiciones ambientales 26. Aunque solo la motilidad basado en células es crítico durante el inicio del desarrollo de la biopelícula en la interfase aire-líquido en bacterias tanto Gram-positivos y negativos 27, biofilms de colonias complejas de B. subtilis no se ven afectados por la supresión de la motilidad flagelar 28. Sin embargo, la organización espacial durante el desarrollo de B. subtilis biofilms de colonias depende de la densidad del inóculo bacteriano utilizado para iniciar el biofilm 8.

Aquí, nosotros usamos B. subtilis para mostrar que la segregación espacial durante la colonización superficie depende del mecanismo de motili nivel de poblaciónTy (es decir, enjambre o deslizante), y el desarrollo de colonias biofilm depende de la densidad celular fundador. Presentamos una herramienta de microscopía de fluorescencia que se puede aplicar para controlar continuamente el crecimiento microbiano biofilm, la colonización de la superficie y surtido en la escala macro. Además, se presenta un método de cuantificación para determinar la abundancia relativa cepa en la población.

Protocol

1. Preparación de medios de cultivo, Semi-sólido placas de agar y Biofilm, Pre-culturas Preparación para el medio pulular y correderas Disolver 2 g de Lenox Broth (LB) y 0,7 g de agar-agar en agua de intercambio iónico 100 ml y autoclave durante 20 minutos a 120 ° C. Utilizar volúmenes pequeños (50-200 ml) para mejorar la reproducibilidad entre los experimentos. Inmediatamente después de la esterilización, cierre la tapa de la botella medio para reducir la evaporación y el lugar en una incubadora a 55 ° C durante al menos 2 horas. Después de que la temperatura del medio ha templado a 55 ° C, se vierte 20 ml de agar de medio LB en un poliestireno diámetro del plato 90 mm Petri bajo una campana estéril de laboratorio. Para los experimentos de lapso de tiempo, se vierte 5 ml de agar de medio LB por 35 mm de diámetro de poliestireno placa de Petri. Cierre la placa de Petri inmediatamente después de verter, la pila no más de 4 placas en la parte superior de la otra y dejar que el medio de agar se solidifique durante al menos 1 hr. 2xSG Medio Pla reparación de la colonia Las biopelículas Disolver 1,6 g de caldo nutritivo, 0,2 g de KCl, 0,05 g de MgSO 4 7H 2 O, y 1,5 g de agar-agar en agua de intercambio iónico 100 ml y autoclave durante 20 minutos a 120 ° C. Utilizar volúmenes pequeños (50-200 ml) para mejorar la reproducibilidad entre los experimentos. Inmediatamente después de la esterilización, cierre la tapa de la botella medio para reducir la evaporación y colocar la botella en una incubadora a 55 ° durante al menos 2 hr. Después de que la temperatura del medio se ha auto-ajustado a 55 ° C, añadir 0,1 ml esterilizada por filtración 1 M Ca (NO 3) 2 solución, 0,1 ml de filtro esterilizado solución 100 mM MnCl 2, 0,1 ml de filtro esterilizado FeSO mM solución 1 4, y 0,5 ml solución de glucosa al 20% estéril. En una campana estéril de laboratorio, verter 20 ml de medio de agar 2x SG por 90 mm de diámetro de poliestireno placa de Petri. Para los experimentos de lapso de tiempo, se vierte 5 ml de agar de medio LB por 35 mm de diámetro de poliestireno placa de Petri. Close la placa de Petri inmediatamente después de verter, la pila de la placa en la parte superior de la otra, pero no más de 4 placas, y dejar que el medio de agar se solidifique durante al menos 1 hr. Preparación de cultivos iniciadores NOTA: El B. subtilis 168, NCIB 3610 cepas derivados utilizados en los métodos descritos a continuación constitutivamente producir proteínas de efecto invernadero o rojo-fluorescencia y se describieron antes 8,27. Las cepas se almacenan de forma rutinaria en el congelador a -80ºC. Inocular cultivos iniciadores de las existencias de -80 ° C en 3 ml de medio LB y se incuba durante la noche (16-18 horas) a 37 ° C con agitación horizontal (225 rpm). No incubar la cultura más de 18 horas tan salvaje aislados de B. subtilis son en su mayoría propensas a agregarse y formar un biofilm en el tubo de ensayo. 2. Co-inoculación de manera fluorescente etiquetadas Cepas bacterianas de superficie de dispersión de El secado de placas de agar semi-sólidas para pulular yEl deslizamiento de B. subtilis. placas de agar secas de enjambre y de deslizamiento para 20 min antes de la inoculación. Placas secas descubiertos en una campana de flujo laminar (ver Figura 1). NOTA: enjambre bacteriana y de deslizamiento depende de la sequedad del medio de agar semisólido. secado insuficiente permite la acumulación de agua en el medio de agar que resulta en la natación flagelo mediada. resultados de tiempo de secado prolongados en la falta de enjambre. Figura 1:.. Flujo de trabajo experimental El procedimiento común se representa en la figura, incluyendo la preparación del medio de cultivo, secado de la detección de la placa, la inoculación y microscopía de fluorescencia (de izquierda a derecha) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Co-inoculaciónde cultivos bacterianos para el pulular y correderas Determinar las densidades ópticas de los cultivos iniciadores durante la noche a 600 nm y mezclar densidad normalizados producir proteínas cepas efecto invernadero y rojo-fluorescentes de B. subtilis NCIB 3610 o su derivado Δ hag en un tubo de reacción de 1,5 ml. Por ejemplo, mezclar 100 l de cepa con 1 (100 * [600 OD de cultivo de una noche de la cepa 1] / [OD 600 de cultivo de una noche de la cepa 2]) l de la cepa 2. Ligeramente vórtice (3 segundos a velocidad máxima) para distribución homogénea. NOTA: B. subtilis NCIB 3610 cepas se inocularon observar enjambre, mientras que sus derivados Δ hag se utilizan para el deslizamiento. Spot 2 l de cultivo mixto en el medio de una placa de pre-secado (véase la Figura 1) y se seca adicionalmente la placa durante 10 min después de la inoculación. Incubar las placas a 37 ° C en posición vertical para permitir que el exceso de humedad se condense en la tapa y no en la superficie del agar. <br /> NOTA: El tiempo de incubación para B. subtilis enjambre es típicamente entre 8-16 horas. Generalmente, el borde de la enjambre alcanza el lado de la 90 mm placa de Petri en 8 hr. Deslizamiento es un proceso más lento y requiere por lo menos 16 a la 42 horas de incubación. Después de 36 h, la parte frontal deslizante alcanza el lado de la placa de Petri de 90 mm. Para los experimentos de lapso de tiempo, coloque los platos de Petri de 35 mm de diámetro en una cámara de incubación etapa precalentado a 37 ° C. Asegúrese de que la tapa de la placa de Petri permanece baja a lo largo de la duración del experimento. Coloque la cubierta de la etapa incubadora a 40 ° C para eludir la formación de humedad en la parte superior de la incubadora. 3. Co-inoculación de manera fluorescente etiquetadas cepas bacterianas con diferentes densidades celulares iniciales El secado de placas de agar para la formación de biofilm de colonias de B. subtilis. Secar las placas para el desarrollo de colonias de biopelículas sin cubierta en un flujo laminarcampana durante 15 min antes de la inoculación. NOTA: resultados de secado insuficientes en el aumento de la humedad y la natación o el enjambre puede ser posible 29. El secado demasiado largos resultado en pequeñas colonias de biopelícula. Preparación de 10 veces cultivos iniciadores diluida para la colonia Las biopelículas Mezclar 100 l de proteína verde-rojo-y fluorescentes que producen cultivos iniciadores durante la noche de B. subtilis 168 en un tubo de reacción 1,5 ml y ligeramente vórtice para la distribución homogénea. Preparar 10 veces serie de dilución en medio LB. Spot 2 l de no diluido o 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 cultivos mixtos diluidos en la placa que contiene medio de biopelícula inductores. NOTA: 6 a 9 colonias biofilm pueden iniciarse en un solo 90 mm placa de Petri teniendo en cuenta que las colonias están separados a igual distancia unos de otros. Incubar las placas a 30 ° C en posición vertical para permitir que el exceso de humedad se condense en la tapa yno en la superficie de agar. NOTA: El tiempo de incubación para B. subtilis biopelícula es entre 1 a 3 días. Generalmente, el biofilm colonia de B. subtilis alcanza su tamaño medio y la estructura compleja en 2 días. Para los experimentos de lapso de tiempo, coloque un solo inóculo en el medio de una placa de Petri de diámetro 35 mm y poner la caja en una cámara de incubación etapa precalentado a 30 ° C. Asegúrese de que la parte superior de la placa de Petri permanece baja a lo largo de la duración del experimento. Coloque la cubierta de la etapa incubadora a 35 ° C para eludir la formación de humedad en la parte superior de la incubadora. 4. Detección fluorescente de Microscopía etiquetadas Cepas Descripción del equipamiento de la Imagen. Para detectar la colonización de la superficie y la señal de fluorescencia, utilice un microscopio estéreo con zoom motorizado de fluorescencia (véase la lista detallada en la Tabla de Materiales) equipado con un objetivo 0,5X PlanApo, dos LEDfuentes de luz fría-(uno para la detección de fluorescencia y uno para la luz visible), conjuntos de filtros para GFP (excitación a 470/40 nm y emisión a 525/50 nm) y mRFP (excitación a 572/25 nm y emisión a 629 / 62 nm), y una cámara monocromática de alta resolución. Realizar la adquisición y procesamiento de imágenes con el software adecuado disponible para el microscopio estéreo con zoom incluyendo multicanal y módulos de lapso de tiempo. Para el experimento lapso de tiempo, utilizar una incubadora de etapa de calentamiento estándar montado en el microscopio con zoom estéreo con un adaptador. Obtención de imágenes de pulular y Expansión deslizante Usa el aumento más bajo para capturar la mayor superficie posible de la placa de 90 mm. Establecer el origen de la inoculación (en el centro de la placa de Petri de 90 mm) a la esquina del campo visible para el seguimiento de la expansión radial bacteriana y fluorescencia. Ajustar el tiempo de exposición óptimo en función de la intensidad de la señal de fluorescencia. NOTA: Para expre constitutivamentegenes de fluorescencia ssed en B. subtilis, verde-rojo-y fluorescencia con tiempos de exposición 1,5 y 3 seg se pueden utilizar, respectivamente. Además, el tiempo de exposición de 10 ms es adecuada para la luz visible. Usar la lente de aumento que permite la detección de toda la colonia biofilm y ajustar la colonia en medio del campo de vista. NOTA: En cuanto a un enjambre y expansiones de deslizamiento, los tiempos de exposición óptimas para detectar las señales de fluorescencia en las colonias de biopelícula depende del nivel de expresión de los genes de codificación de proteínas fluorescentes. Para los resultados representativos a continuación, se detectó efecto invernadero y rojo-fluorescencia utilizando intervalos de 1 y 3 segundos de exposición, respectivamente. Para imagen de lapso de tiempo, obtener imágenes a ciertos intervalos utilizando tiempos de exposición constante. Guardar las imágenes grabadas estereoscópicos de fluorescencia en un formato de archivo que es reconocido por el software ImageJ para el análisis de datos cuantitativos. 5. Datun análisis Para analizar el área ocupada por cada cepa fluorescente de la etiqueta diferente, abra el archivo de interés en el software ImageJ ampliado con un plugin BioVoxxel. Cuando una ventana llamada "Formatos-Bio Opciones de importación" parece que sólo las opciones "Abrir todas las series" y "Escala automática" se ha seleccionado, abra el archivo haciendo clic en "Aceptar". NOTA: Los archivos se muestran como una serie de tres imágenes, una para cada canal utilizado para grabar una imagen en el microscopio (verde-rojo-fluorescencia y las imágenes de campo claro). Se separa la pila en imágenes de canales individuales mediante la selección de "Imagen" – "Pilas" – "Pila de imágenes" en el panel de control ImageJ. NOTA: Las imágenes aparecen y se numeran como 1/3 (canal verde), 2/3 (canal rojo) y 3/3 (campo claro). Aquí, la imagen de campo brillante se excluye del análisis. Para analizar las imágenes, transformar cada uno en una imagen de 8 bits, seleccionando"Imagen" – "Tipo" – "8 bits". Para determinar la zona ocupada en píxeles 2, restablecer la escala de las imágenes usando "Analizar" – "Establecer Escala". Cuando se abre una ventana con diferentes opciones de escala, restablecer la escala mediante la selección de "Haga clic para eliminar las escamas". Marque la opción "Global" para eliminar la escala para todas las imágenes abiertas. Para eliminar el fondo, dibuja un área ovalada (región de interés, ROI) fuera del área fluorescente con la función "oval" en el panel de control de ImageJ. Para asegurar que el tamaño del óvalo de fondo es la misma para todas las imágenes analizadas, añadirlo a la gerente de retorno de la inversión a través del personaje [t] del teclado. Una ventana del Administrador de retorno de la inversión llega hasta donde el retorno de la inversión ovalada de fondo puede ser salvado a través de "Más" – las opciones de "Guardar". Si el retorno de la inversión ovalada de fondo es visible en la imagen, medir la intensidad de la zona por la elección de "Analizar" – "medida". NOTA: Los resultados Aventana donde, entre otros, la intensidad media de fluorescencia se muestra en la columna denominada "media". Restar el valor de la intensidad media de fluorescencia de fondo de la imagen anulando la selección del ROI ovalada de fondo, haga clic en "Proceso" – "Matemáticas" – "restar" e insertando el valor medido. Aplicar un umbral a la imagen a través de la "Imagen" – "Ajuste" – opción "Umbral". Seleccione el método de Otsu y blanco y negro (B & W). Marque la opción "Fondo oscuro" y emplear el umbral haciendo clic en "Aplicar". Nota: La imagen se convierte en una imagen binaria donde se muestra la zona por encima del umbral de blanco y que por debajo del umbral se muestra en negro. Seleccionar todo por encima del umbral a través de la "Analizar" – opción "Analizar Partículas". En la ventana con la configuración, mantenga las opciones predeterminadas y mantener los "Mostrar resultados" y "Summarize "opciones marcadas. Haga clic en" OK "para mostrar el resumen en la ventana de resultados y los del área ocupada en la columna denominada" Área Total ".

Representative Results

sistemas de laboratorio de las poblaciones bacterianas proporcionan un enfoque atractivo para explorar cuestiones ecológicos o evolutivos. Aquí, tres modos de colonización de la superficie B. subtilis se utilizaron para examinar la aparición de surtido de la población, es decir, la segregación de genéticamente idénticos, pero con fluorescencia diferentes cepas etiquetados. Un enjambre, que es un movimiento en la superficie depende colectiva flagelo de B. subtilis, resulta en una población altamente mezclada. En estas colonias enjambre, las bacterias de efecto invernadero y rojo fluorescente zonas colonizadas se solapaban (véase la Figura 2A). La colonización superficial rápida se puede seguir en el tiempo (Video Figura 1). Durante enjambre de B. subtilis, una fina capa de células se expande desde el centro de la inoculación después de unas horas de incubación (véase la figura 2B). 4752 / 54752fig2.jpg "/> Figura 2: El pulular expansión de B. . subtilis La colonia enjambre contiene cepas al verde y al rojo fluorescente que se mezclaron 1: 1 antes de la inoculación. (A) Después de 15 horas, el efecto invernadero y el rojo-fluorescencia (GFP y RFP, respectivamente) fueron detectados con filtros de fluorescencia adecuados. (B) Las imágenes de la capa delgada de enjambre B. subtilis se muestran en los puntos de tiempo seleccionados extraídos de vídeo Figura 1. Barra de escala = 5 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Sin embargo, cuando B. cepas subtilis, que carecen de flagelos funcional, pero que son capaces de difundir con la ayuda de exopolisacáridos producidos, hidrofobina y surfactina, fueron vistos en medio de agar semisólido, las cepas diferente marcadas se separan en cierta defsectores INED (véase la Figura 3A). El desarrollo de la colonia de deslizamiento se puede grabar en el tiempo (véase la Figura 3B o vídeo Figura 2). Figura 3: El deslizamiento de la colonia B. . La colonia subtilis contiene cepas al verde y al rojo fluorescente que se mezclaron 1: 1 antes de la inoculación. (A) Después de 24 horas, el efecto invernadero y el rojo-fluorescencia (GFP y RFP, respectivamente) fueron detectados con filtros de fluorescencia adecuados. (B) Las imágenes de la B. subtilis disco de deslizamiento se muestran en los puntos de tiempo seleccionados extraídos de vídeo Figura 2. Barra de escala = 5 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Si bien los niveles de surtido de enjambre y SLIding colonias en expansión no podían ser modificados, la segregación espacial de las cepas fluorescentes marcados de forma diferente en el biofilm colonia podría estar influenciada por las densidades de células de partida. Cuando una biopelícula colonia de B. subtilis se inició con alta densidad celular de las poblaciones mixtas, las cepas al verde y al rojo fluorescente mostraron menor o ninguna variedad espacial (ver Figura 4). Por el contrario, cuando la densidad celular para iniciar la biolfilm era baja, sectores invernadero y rojo en fluorescencia claras podían detectarse por microscopía de fluorescencia. El nivel de surtido fue claramente dependiente del nivel de dilución de la población de iniciar biofilm. Vídeo Figura 3 y 4 presentan la expansión de la colonia para la dilución más baja y la más alta de las cepas inoculadas. Figura 4: nivel de surtido en las biopelículas de colonias de B. subtilis en. varias densidades celulares iniciales Los biofilms de colonias de las cepas de invernadero y rojo en fluorescencia se muestran después de 2 días que fueron inoculados con diferentes densidades de células iniciales (de arriba a abajo: no diluidas a 10 5 veces diluidas iniciar cultivos, respectivamente). Barra de escala = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La relación de cepas de efecto invernadero y rojo fluorescente se puede cuantificar adicionalmente usando software ImageJ que permite la caracterización cuantitativa de la estructura de la población y la competitividad de las cepas utilizadas para los experimentos. Vídeo Figura 1: Lapso de tiempo images de enjambre B. subtilis inició con 1:. 1 mezcla de cepas al verde y al rojo fluorescente (Haga clic derecho para descargar). El video muestra a un curso de tiempo de 10 horas. Barra de escala = 7 mm. Vídeo Figura 2: imágenes Lapso de tiempo de deslizamiento B. subtilis inició con 1:. 1 mezcla de cepas al verde y al rojo fluorescente (Haga clic derecho para descargar.) El video muestra a un transcurso de tiempo de 24 horas. Barra de escala = 5 mm. Vídeo Figura 3: imágenes Lapso de tiempo de B. biofilms subtilis colonias iniciaron con 1: 1 mezcla de verde-. Y cepas rojo fluorescente a altas densidades celulares (Haga clic derecho para descargar). El video muestra a un curso de tiempo de 48 horas. Barra de escala = 5 mm. Vídeo Figura 4: Imágenes Lapso de tiempo de B. biofilms subtilis colonias iniciaron con 1: 1 mezcla de las cepas de efecto invernadero y rojo fluorescente a bajas densidades celulares. (Haga clic derecho para descargar.) El video muestra a un transcurso de tiempo de 48 horas. Barra de escala = 5 mm.

Discussion

La disponibilidad de una caja de herramientas fluorescente para las bacterias facilita no sólo el estudio de la expresión génica heterogéneo 30,31 y la proteína de localización 32, pero también el análisis de la distribución espacial de las cepas dentro de una población 8. marcadores fluorescentes con longitudes de onda suficientemente diferentes de excitación y emisión permiten localizar claramente dos cepas que de otro modo son indistinguibles entre sí cuando se mezclan. El protocolo descrito se puede emplear para la observación de la dinámica de población en cultivos mixtos, por ejemplo, experimentos de competición o sinergismo entre cepas o especies. La capacidad para determinar las abundancias relativas de la etiqueta fluorescente cepas en una población mixta no se limita a enjambre adjunto, deslizante, o colonias de biopelícula superficie, pero también se puede usar para otros sistemas de biopelículas multicelulares, incluyendo sumergido, interfaz celular o de aire medio de flujo Las biopelículas 27,33-35.

_content "> Si bien la técnica presentada es una herramienta poderosa para detectar la distribución espacial de las cepas y los experimentos de competición de diseño, sino que también permite siguiente heterogeneidad de la expresión génica en las colonias en expansión. Las condiciones de cultivo descritas aquí se aplican para B. subtilis y los parámetros exactos para la expansión en agar medios pueden requerir optimización para otras especies o cepas 20. Colocar las muestras en una cámara de incubación mientras que las imágenes permite al experimentador para seguir la dinámica de población en el tiempo, aunque hay que prestar atención a los niveles de humedad dentro de la cámara durante la incubación.

Las técnicas descritas aquí también requieren la modificación genética de las cepas bacterianas examinados hasta que las cepas expresan marcadores fluorescentes que se pueden distinguir unos de otros. Por otra parte, además de tener la excitación distinta y espectros de emisión, se recomienda que los dos marcadores fluorescentes elegidos tienen cuant similaresrendimientos um (es decir, proporción de fotones absorbidos que se emiten) y se expresan en un nivel comparable. Además, los cambios de intensidad relativa en el tiempo se pueden medir y normalizado a un punto de tiempo de un experimento temprano. El aumento relativo o la disminución pueden ser luego comparados entre los diferentes fluoróforos con diferentes eficiencias cuánticas. Para el sistema experimental presentado, diferentes proteínas verde-rojo-y fluorescentes se probaron previamente 36,37 para seleccionar los pares fluorescentes más óptimos que pueden ser detectados en B. subtilis. El tiempo de exposición óptimo debe determinarse para cada proteína fluorescente y la muestra. Ciertos densidades de células o múltiples capas de células podrían ser necesarias para detectar la señal de manera eficiente dentro de la población. Ciertas proteínas fluorescentes pueden tener intensidades bajas en las células bacterianas debido a la expresión ineficiente y / o traducción de la proteína y por lo tanto el rendimiento bajo cuántica. Tales marcadores fluorescentes ineficientes podría reducir la sensibilidad del sistema y extender el tiempo necesario para detectar las cepas bacterianas posiblemente resultantes de la citotoxicidad por la luz de excitación. Las intensidades fluorescentes pueden ser modificado en consecuencia alterando el promotor usado para expresar el gen que codifica reportero fluorescente. Un nivel de expresión que es demasiado alta podría dar lugar a exceso de producción innecesaria de la proteína fluorescente que conduce a costes de fitness perjudiciales para la bacteria. Al realizar experimentos de competición, se debe considerar el costo de producción particular, la proteína fluorescente en las células. Los experimentos de control, en los que los marcadores fluorescentes se intercambian entre las cepas competido o donde dos cepas isogénicas que sólo difieren en sus marcadores fluorescentes se compitieron entre sí, siempre se requieren para determinar cualquier sesgo hacia un marcador. Los tiempos de vida de las proteínas fluorescentes dentro de las células también pueden afectar a la intensidad medida. Además, la autofluorescencia de cierta especie bacterianas puede requerir el uso de diferentes marcadores fluorescentes diferentes a las descritas aquí.

Para determinar con precisión la distribución espacial y abundancia de las cepas bacterianas distintas, la señal de fondo procedente de la primera proteína fluorescente mientras se usa el filtro de fluorescencia para el segundo marcador fluorescente y viceversa debe probarse de forma individual en las muestras de monocultivos (que contiene bacterias que producen sólo un marcador ). Esto permite la sustracción de la superposición de las intensidades de señal fluorescente. Es importante destacar que, como el microscopio estereoscópico registra la señal de fluorescencia por encima de la colonia en expansión, el protocolo que se presenta es conveniente para determinar la disposición espacial en dos dimensiones. La arquitectura de la población bacteriana en expansión podría resultar en niveles de fluorescencia diferentes (es decir, estructuras de arrugas como podrían contener más células que muestran intensidades de fluorescencia locales más altas). Por lo tanto, el análisis de las imágenes se ha descrito determines la distribución espacial, pero no la abundancia de las cepas dentro de un lugar determinado. Protocolos anteriores se ha descrito la preparación de la muestra para el enjambre 20 o imágenes de fluorescencia de la dinámica de la población en 38 colonias de bacterias, pero nuestro protocolo combina estas técnicas. Otras técnicas de microscopía que permiten la observación de tres resolución dimensional de la estructura de la población (por ejemplo confocal láser de barrido La microscopía 39,40 o estructurada microscopía de iluminación 41) se pueden aplicar para las muestras con un aumento de la complejidad estructural. Estas técnicas adicionales también apoyan la detección basada en una sola célula de las cepas 31 que no está disponible utilizando el microscopio estereoscópico.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la subvención KO4741 / 3-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Además, el laboratorio de Á.TK fue apoyado por una beca Marie Sklodowska integración carrera Curie (PheHetBacBiofilm) y conceder KO4741 / 2-1 de la DFG. TH, AD, RG-M., Y EM fueron apoyados por la Escuela Internacional Max Planck de Investigación, Fundación Alexander von Humboldt, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología-alemán Servicio de Intercambio Académico (DAAD-CONACyT), y las becas JSMC, respectivamente.

Materials

Lennox Broth (LB) Carl Roth GmbH X964
Agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH 5210
Petri dish (90 mm diameter) any NA Use Petri dishes without ventillation cams
Petri dish (35 mm diameter) any NA Use Petri dishes without ventillation cams
Difco Nutrient Broth BD Europe 234000
KCl any NA
MgSO4 7H2O any NA
Ca(NO3)2 4H2O any NA
MnCl24H2O any NA
FeSO4 any NA
D-Glucose any NA
Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH see bellow detailed description
AxioZoom V16 Microscope body Carl Zeiss Microscopy GmbH 435080 9030 000
Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9020 000 without eyepieces
Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9060 000
Controller EMS 3 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435610 9010 000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435611 9010 000
Reflector module Z Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9160 000 For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3
Filter set 38 HE eGFP shift free (E) Carl Zeiss Microscopy GmbH 489038 9901 000 EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50
Filter set 63 HE mRFP shift free (E) Carl Zeiss Microscopy GmbH 489063 0000 000 EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62
Mount S Carl Zeiss Microscopy GmbH 435402 0000 000
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114mm Carl Zeiss Microscopy GmbH 435280 9050 000 164mm parfocal length; M62x0.75 thread at front
Coarse/fine drive with profile column Carl Zeiss Microscopy GmbH 435400 0000 000 490 mm, 10kg load capacity, compatible with stand bases 300/450
Stand base 450 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435430 9902 000
Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN Carl Zeiss Microscopy GmbH 435700 9000 000
CAN-bus cable Carl Zeiss Microscopy GmbH 457411 9011 000 2.5 m length
Slit-ring illuminator Carl Zeiss Microscopy GmbH 417075 9010 000 d=66 mm
Flexible light guide 1500 Carl Zeiss Microscopy GmbH 417063 9901 000 8/1000 mm 
Illumination Adapter for light guide Carl Zeiss Microscopy GmbH 000000 1370 927
Lightguide HXP with liquid fill Carl Zeiss Microscopy GmbH 000000 0482 760 ø3mm x 2000mm
Camera Adapter 60N-C  Carl Zeiss Microscopy GmbH 426113 0000 000 2/3" 0.63x
High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire Carl Zeiss Microscopy GmbH 426509 9901 000
AxioCam FireWire Trigger Cable Set Carl Zeiss Microscopy GmbH 426506 0002 000 for direct shutter synchronization
ZEN pro 2012 Carl Zeiss Microscopy GmbH 410135 1002 120 Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss Microscopy GmbH 410136 1031 110
Standard Heating Stage Top Incubator Tokai Hit INUL-MS1-F1
Zeiss Stereo Microscope Base Adapter Tokai Hit MS-V12
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Image J National Institute of Health, Bethesda, MD, USA v 1.49m
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Hölscher, T., Dragoš, A., Gallegos-Monterrosa, R., Martin, M., Mhatre, E., Richter, A., Kovács, Á. T. Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations. J. Vis. Exp. (116), e54752, doi:10.3791/54752 (2016).
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