Las perturbaciones de circulación miRNAs en el Síndrome del Intestino Irritable detectó utilizando una plataforma de expresión de genes de multiplexado de alto rendimiento
Summary
We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Abstract
El ensayo de la plataforma de la expresión de genes permite la robusta y altamente reproducible cuantificación de la expresión de hasta 800 transcripciones de ARNm (o miRNAs) en una sola reacción. El ensayo miARN transcripciones cuenta por imágenes de forma directa y contando digitalmente moléculas de miRNA que están etiquetados con conjuntos codificados por colores fluorescentes con código de barras de la sonda (una sonda reportero y una sonda de captura). Los códigos de barras se hibridan directamente a madurar miRNAs que han sido alargadas mediante la ligación de un oligonucleótido de etiqueta única (miRtag) al extremo 3 '. No se requiere la transcripción inversa y la amplificación de las transcripciones. sondas informadoras contienen una secuencia de seis posiciones de color pobladas usando una combinación de cuatro colores fluorescentes. Los cuatro colores más de seis posiciones se utilizan para construir una secuencia de colores de código de barras específico de gen. El procesamiento posterior a la hibridación está automatizado en una estación de la preparación robótica. Después de la hibridación, las sondas en exceso se eliminan por lavado, y las estructuras tripartitas (Capture Proser-miARN-reporter sonda) están fijados a un portaobjetos recubierta con estreptavidina a través de la sonda de captura marcada con biotina. De imágenes de código de barras y el recuento se realiza mediante un analizador digital. El miRNAs con código de barras inmovilizadas se visualizan y imágenes utilizando un microscopio y la cámara, y los códigos de barras únicos se descodifican y se contaron. control de calidad de los datos (control de calidad), la normalización y el análisis se ven facilitadas por un software de procesamiento y análisis de datos de diseño personalizado que acompaña al software de análisis. El ensayo demuestra una alta linealidad en un amplio intervalo de expresión, así como de alta sensibilidad. Y preparación de muestras de ensayo no implica reacciones enzimáticas, la transcripción inversa, o la amplificación; tiene unos pasos; y está muy automatizado, reduciendo los efectos del investigador y lo que resulta en una alta consistencia y reproducibilidad técnica. A continuación, describimos la aplicación de esta tecnología para la identificación de las perturbaciones que circulan miARN en el síndrome del intestino irritable.
Introduction
Síndrome del Intestino Irritable (SII) es el diagnóstico más común para pacientes ambulatorios en Gastroenterología, que afecta a 10 – 15% de la población general y que representa una carga significativa en los servicios de salud. Biomarcadores de diagnóstico Actualmente, no hay generalmente aceptados para el SII (es decir, el diagnóstico se basa en los síntomas clínicos y descartando otros trastornos orgánicos, tales como malignidad gastrointestinal, enfermedades inflamatorias del intestino, y gastrointestinales (GI) infecciones). Al estudiar los perfiles de expresión de genes en condiciones comunes con histopatología subclínica, tales como IBS, alta sensibilidad y precisión (reproducibilidad) son necesarios, como perturbaciones en los perfiles de expresión de genes son a menudo sutiles 1-3. miRNAs han sido identificados como los dos dianas diagnósticas y funcionales en el SII 4,5, y estamos particularmente interesados en la evaluación de su uso como biomarcadores de 3,4,6,7 perturbaciones biológicas asociadas-IBS circulante. La utilización clínica de Circulabiomarcadores ting es de interés actual debido a la facilidad y la naturaleza mínimamente invasiva de la colección de la fuente de los biomarcadores (por ejemplo, sangre periférica) de pacientes.
Los ensayos de plataforma de expresión de genes, debido a su composición química única y flujo de trabajo racionalizado, sobre todo automatizado, proporcionan una plataforma de microarrays que proporciona cobertura amplia y personalizable (800 objetivos en una sola reacción) del transcriptoma para el descubrimiento de destino. También producen una alta precisión y linealidad en un amplio espectro de niveles de expresión en la cuantificación de los objetivos transcriptomic. El ensayo no requiere la transcripción inversa del ARN, la amplificación del cDNA resultante, o cualquier otras reacciones enzimáticas. Por lo tanto, los posibles errores introducidos por los altos números de ciclos de amplificación a partir de especies de ARN con baja abundancia o variantes de empalme raras son reducidos por el proceso de recuento digital. Esto significa que una amplia variedad de tipos de muestras, tales como Total purificadoRNA (es decir, mRNA + miARN), ARN a partir de muestras fijadas con formalina embebidos en parafina (FFPE), así como el tejido crudo y los lisados celulares, se puede utilizar con los ensayos.
ARN de interés se detectan usando un par de sondas (de captura y sondas informadoras), cada uno que contiene una secuencia específica de la diana que reconoce una región correspondiente en el ARN diana. A fin de garantizar la detección de ARN cortos (es decir, miRNAs), la secuencia de los genes miARN maduro es alargada por recocido de una marca de oligonucleótido único (miRtag) al extremo 3 'de la molécula. Un oligonucleótido puente, que es complementaria de una porción de tanto el objetivo miARN maduro y el miRtag miARN-específica, se utiliza para asegurar la especificidad de secuencia. Captura y sondas informadoras ligate a los 3 'y 5' del complejo madura miARN-miRtag, respectivamente. Las sondas de captura tienen una marca de biotina en el extremo 3 ', que les permiten adherirse a la superficie de un portaobjetos de vidrio revestida con estreptavidina, FIXIng de la captura de la sonda-miARN-miRtag-reportero complejo de la sonda a la diapositiva. Una corriente eléctrica se utiliza para orientar el complejo en la superficie de deslizamiento, lo que permite códigos de barras fluorescentes realizadas por la sonda indicadora en el extremo 5 'que se visualizaron utilizando un microscopio y un dispositivo de acoplamiento de carga de la cámara (CCD). Los códigos de barras se cuentan y decodificados, produciendo un recuento de los miRNAs objetivo específicos. El código de barras fluorescente consta de seis posiciones que pueden ser ocupadas por uno de los cuatro colores fluorescentes, que se pueden utilizar para construir más de 4.000 combinaciones de color de códigos de barras, cada uno de codificación para un RNA específico.
Preparación de la muestra (es decir, la purificación del ARN y / o preparación de lisado de tejido celular), así como la hibridación de las sondas de captura y reportero, se llevan a cabo en el banco. Doce muestras pueden ser multiplexados en una sola diapositiva. Después de la hibridación durante una noche, toda la preparación más espécimen se lleva a cabo por una estación de la preparación robótico. Los portaobjetos cargados se transfieren a adanalizador igital para formación de imágenes, el recuento, la decodificación, y procesamiento de datos. Los datos resultantes se importan al software que lo acompaña, donde se procesan adicionalmente con un alto grado de control del usuario. La química única, una preparación simple, la naturaleza automatizada, tipo de dato simple (cuentas), y flujo de trabajo racionalizado general del ensayo de facilitar la alta precisión de la expresión génica cuantificación, por lo que es una herramienta útil en el estudio que circulan perfiles y firmas de expresión de los genes miARN en condiciones funcionales, tales como IBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Para el ensayo de miARN en particular, es crítico a no utilizar lisados no purificados (estos pueden ser utilizados en el ARNm y los ensayos de proteínas), ya que los reactivos no se han optimizado para su uso con lisados, y las reacciones de preparación de muestras son susceptibles de ser inhibido. Además, los contaminantes transferirse de pasos de lisis y purificación de ARN (por ejemplo, compuestos de guanidinio, etanol, y fenoles) puede inhibir la ligadura y la Purificación de la muestra reacciones. RNA de buena calidad, por lo tanto es crítico para la sensibilidad y la exactitud del ensayo miRNA.
El uso de un termociclador con una tapa calentada es crítica para asegurar el control de temperatura adecuada para optimizar el rendimiento de todas las etapas de reacción. Durante el paso 3.5.1, es importante no eliminar las tiras de la termociclador con el fin de mantener la temperatura durante la adición de la ligasa. La eliminación de las tiras para agregar la ligasapondrá en peligro la reacción. Al llevar a cabo las etapas de hibridación, es fundamental para evitar una agitación vigorosa, pipeteado, o prender cuando se mezclan los reactivos en los tubos, ya que esto podría romper las sondas indicadoras. Para garantizar un rendimiento óptimo y la consistencia, es importante para mezclar completamente los reactivos en los tubos con un movimiento rápido suave. Siempre de girar reacciones después de la mezcla, y el uso de una nueva pipeta de punta cada vez que un reactivo se dispensa para asegurar el pipeteo preciso y para evitar la contaminación cruzada accidental.
Modificaciones y solución de problemas
Los conjuntos de códigos pueden ser personalizados para incluir sólo los objetivos de interés. De esta manera, los costos pueden ser equilibradas para permitir la comprobación de grandes conjuntos de la muestra cuando se investiga más o validación de un bio-firma. Sondas personalizadas pueden ser diseñadas para los genes o no los objetivos disponibles en el menú a la carta. La sensibilidad para objetivos menos abundantes o ARN de baja concentración puede sermanipulado por lo que permite un tiempo de hibridación más largo y / o mediante el uso de recuento digital de mayor resolución.
En nuestro estudio hemos utilizado el panel de destino predefinido 800 miRNA con el ARN total a partir de sangre entera; Sin embargo, los ensayos pueden ser personalizados para incluir un menor número de miRNAs si se necesita un enfoque más específico. Un total de 24 muestras se puede preparar en un solo día, escalonados en dos series de 12, debido a que dos cartuchos cómodamente se pueden pasar a través del procesamiento posterior a la hibridación en la estación de la preparación robótica y la imagen en el analizador digital de al día siguiente. procesamiento escalonada de las muestras en lotes de 12 es importante para estandarizar el tiempo de hibridación. Los cartuchos que han sido fotografiadas pueden ser guardados y almacenados a volver a escanear 4 ° C si los análisis de datos sugieren que una exploración de una resolución más alta puede mejorar la detección de miRNAs más raras. La detección de moléculas más raras también puede mejorarse mediante la hibridación de muestras durante más tiempo; Sin embargo, la hibridación prolongada puede Result en la sobresaturación y sólo pueden mejorar los resultados si las concentraciones de partida de ARN son bajos (como en el ARN extracelular de vesículas derivado). la sensibilidad y la precisión de la plataforma permiten relativamente baja abundancia miRNAs a ser contados de forma fiable.
Limitaciones de la Técnica
La plataforma de ensayo de expresión génica se describe solamente tiene capacidad para hasta 800 objetivos por conjunto. Por lo tanto, no es adecuado para los estudios del transcriptoma enteros toda miARN-transcriptoma /. Sólo conocidos, descritos, y los objetivos especificados se pueden detectar usando la plataforma, por lo que no es adecuado para el descubrimiento de nuevas especies moleculares. Otros métodos, como RNASeq u otros métodos tradicionales de microarrays, son más adecuadas para toda transcriptoma estudios exploratorios.
Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes
IBS se caracteriza por una combinación de síntomas, prinincluyendo palmente dolor abdominal; hipersensibilidad visceral; y cambios en los hábitos intestinales, como diarrea frecuente, estreñimiento, o una combinación de ambos 9,10. Los síntomas del SII no tienen una causa orgánica conocida, y los pacientes no presentan con la inflamación clínicamente significativa, perturbaciones gastrointestinales histopatológicas de tejidos o marcadores sistémicos 9-12. La investigación sugiere que la desregulación biológica en el SII es sutil, subclínica y heterogénea, con temas comunes que emerge en torno inflamación y la función inmune 10. Por lo tanto, teníamos que controlar la variación experimentador a introducir y utilizar una plataforma que fue capaz de detectar de forma fiable las perturbaciones sutiles en la expresión génica. Los atributos únicos del ensayo y el sistema de procesamiento de la muestra estandarizar y reducir experimentador manipulación a través de la automatización, reduciendo la variación técnica para producir datos altamente reproducibles. Estas características permiten investigaciones enfocadas y producen altamente preciso y replicable datos. Esto permite la detección de las perturbaciones sutiles y perturbaciones entre los objetivos de bajo de expresión que pueden ser pasados por alto o inundado por las señales de los objetivos más abundantes utilizando intensidad- o basados en la amplificación métodos. microarrays basados en la PCR y métodos RNAseq son alternativas viables a través de la plataforma se describe y pueden ser atractivos como alternativa cuando se requieren mayores rendimientos o cuando el objetivo es caracterizar todo el transcriptoma o para buscar nuevas moléculas. Sin embargo, las alternativas pueden no funcionar tan bien en la detección y cuantificación de objetivos nobles y perturbaciones sutiles con precisión y sensibilidad.
Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica
Que circula miARN expresión en los participantes de IBS mostró una serie de perturbaciones que se han encontrado para ser significativa y coherente dentro de las categorías. El miRNAs identificados fueron asociados con pathwa relevanteys y condiciones patológicas, incluyendo una condición funcional del dolor (miR-342-3p: el dolor crónico de la vejiga) 8 y la inflamación (miR-150) 13. El estudio ejemplo se basa en una cohorte de exploración se utiliza para definir los objetivos y sistemas de interés. a continuación, se construyó una, más pequeña gama miARN más específico, la reducción del coste de la muestra y por ser analizada de manera rentable a fin de validar y refinar las firmas y los biomarcadores que permite para las cohortes más grandes. El sistema de ensayo plataforma de expresión génica establece un equilibrio entre la naturaleza exploratoria tradicional de la micromatriz y más específico, la recopilación de datos basadas en hipótesis de refinar y evaluar las firmas moleculares y biomarcadores 14-16. El método se puede utilizar para examinar perturbaciones moleculares y proteína en in vivo y en modelos in vitro, donde los miRNAs objetivo descritos son experimentalmente sobre-expresado o inhibe. Nuevos ensayos permiten la cuantificación simultánea de mRNAs y proteins directamente a partir de lisados de células y tejidos. Además, mediante la optimización de la purificación de las fracciones específicas de la sangre periférica y los excrementos (por ejemplo, orina) y por personalizar y optimizar ciertos parámetros del ensayo, perfiles moleculares y las firmas de fracciones de concentración molecular bajo (por ejemplo, fracciones exosomal) se examinarán.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
Materials
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
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