Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Суточный часы функционируют во всех светочувствительных организмов, что обеспечивает адаптацию к внешнему миру, предвосхищая ежедневные изменения окружающей среды. Значительный прогресс в понимании тесной связи между циркадных часов и большинство аспектов физиологии было сделано в области за последнее десятилетие. Тем не менее, распутывая молекулярную основу, лежащую в основе функции циркадного осциллятора в организме человека остается высшей технической задачей. Здесь мы приводим подробное описание экспериментального подхода для долгосрочного (2-5 дней) записи биолюминесценции и сбора Отток среды в культивируемых первичных клеток человека. С этой целью мы трансдуцированных первичных клеток с лентивирусов люциферазы, который находится под контролем промотора гена тактовой, что позволяет параллельной оценки секреции гормонов и циркадного биолюминесценции. Кроме того, мы опишем условия для нарушения циркадных часов в прimary человеческие клетки путем трансфекции миРНК таргетирования часами. Наши результаты на циркадный регуляции секреции инсулина поджелудочной железы человека, и myokine секрецию скелетных мышечных клеток человека, которые представлены здесь, чтобы проиллюстрировать применение этой методологии. Эти параметры могут быть использованы для изучения молекулярной состав периферических часов человека и проанализировать их функциональное воздействие на первичные клетки в физиологических или патофизиологических условиях.
Introduction
Циркадная система синхронизации (от латинского "Circa Diem") возникла во всех светочувствительных организмов, как адаптивный механизм с вращением Земли. У млекопитающих, она организована по иерархическому принципу, охватывая центральный синхронизатор, который находится в ядре супрахиазматического вентральной гипоталамусе, и периферической (или ведомый) осцилляторы, которые действуют в различных органах. Кроме того, эти клеточные автономные хозрасчетные осцилляторы функционируют почти в каждой клетке тела 1. Световые сигналы представляют собой доминирующую синхронизирующий кий (Zeitgeber) для нейронов SCN, в то время как нервные и гуморальные сигналы , исходящие от SCN сброса периферийных часов. В ритмах отдых-активность : сложение, что диск в свою очередь кормления натощак циклов, являются дополнительными синхронизаторы для периферийных часов 2. Согласно нашему современному пониманию, молекулярный состав ядра процессора основан на транскрипционный и translaные петли обратной связи, которые являются консервативными между организмами. Это включает транскрипционные активаторы BMAL1 и часы, которые вместе активируют транскрипцию генов отрицательных тактовая PER и крика. Высокие уровни PER и кричи белков будет препятствовать их собственную транскрипцию путем ингибирования / ЧАСЫ комплекса BMAL1. Вспомогательный контур состоит из ядерных рецепторов REV-Erbs и калах, которые также регулируют транскрипцию BMAL1 и ЧАСЫ. Кроме того, посттрансляционные события , включая фосфорилирование, SUMOylation, ацетилирование, O-GlcNAcylation, деградации и ядерной записи частоте ядра белки представляют собой дополнительный слой важную регуляторную при установлении 24 – часовом цикле колебаний 3.
Накопленные данные проистекает из исследований в моделях на грызунах и подчеркивает важнейшую роль циркадного системы в координации метаболических и эндокринных функций 4-5. Ряд LARGэлектронной шкалы анализ транскриптом предполагают , что кормление – голодание циклы играют центральную роль в синхронизации периферических осцилляторов 6-8. В согласии с этими исследованиями, метаболомики и липидомных анализ у грызунов и человека показали , что большое количество метаболитов осциллируют в ткани, плазмы и слюны в циркадных образом 9-11. Важно отметить, что большинство гормонов демонстрируют циркадные ритмы в 5,12-13 крови. Кроме того, циркадные часы из соответствующего гормонпродуцирующих периферических тканей может регулировать секрецию гормонов на местном уровне. Клеточно-автономным циркадные осцилляторы были описаны в грызунах и островковых клеток поджелудочной железы человека 14-16. Эти осцилляторы играют существенную роль в регуляции островков поджелудочной железы транскриптом и функции 15,17-18. Кроме того, myokine секрецию скелетных мышечных трубочек человека было недавно продемонстрировано, демонстрируют циркадный паттерн, который регулируется клеточно-автономным oscillatoRS оперативные в этих клетках 19.
Существует несколько подходов к изучению циркадных ритмов в организме человека в естественных условиях широко используются. Например, плазменный мелатонин или уровень кортизола в крови, а также грудные температура поверхности кожи (обзор в ссылках 3,20) были изучены для оценки эндогенных циркадных часов. Хотя эти методы позволяют изучать системные циркадные колебания в естественных условиях, они далеки от обеспечения надежной оценки обгонной автономных циркадных ритмов в различных органах и тканях. Тем не менее, такое рассечение от системного регулирования станет незаменимым инструментом для понимания специфического действия внутриклеточных молекулярных часов на функции этих клеток. Таким образом, значительные усилия были предприняты для разработки надежных подходов для изучения человеческих часов в иммортализованных или первичных культивированных клеток синхронизированных в пробирке. Важно то, что было показано, чтоЧасы характеристики , измеренные в культивируемых клетках первичных фибробластов кожи точно отражают индивидуальные тактовые свойства всего организма 21. Развитие флуоресцентных и биолюминесценции циркадных репортеров значительно продвинулся вперед этот подход 22-27. Кроме того, изучая первичные часы клеток, которые получают из различных периферических органов позволяет для исследования свойств молекул тканесецифического часы человека 3,5,16,19-20,28. Таким образом, оценка циркадных часов в пробирке в синхронизированных первичных эксплантов или клетки, с помощью биолюминесцентного репортеров, представляет собой весьма полезный метод для изучения молекулярной состав периферических часов человека и их влияние на функции органа.
В этой статье мы представим подробные протоколы для оценки циркадных экспрессии генов в первичных островковых и скелетных мышечных клеток человека синхронизированных в пробирке, а также влияния автономных клеточных часовСрыв на секреторную функцию этих клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальные установки , описанные здесь , состоят из лентивирусов доставки циркадных репортеров биолюминесценции в культивируемых первичных клеток человека, с последующей синхронизацией в пробирке и непрерывной записи биолюминесценции в течение нескольких дней, и паралл…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны нашим коллегам из Университета Женевы: Жак Филипп за конструктивные замечания по этой работе, Ули Schibler за неоценимую помощь в развитии системы perifusion и для научного вдохновения, Андре Liani для задумав проектирование, изготовление и ввод в эксплуатацию система перфузия, компания Леза-Technology LTD за помощь в системе perifusion и разработки программного обеспечения Капельное-biolumicorder, Джордж Severi за помощь при проведении экспериментов perifusion, Урсула Loizides-Мангольд для критически чтении рукописи, и Анн-Мари Маклуф для лентивирус препаратов ; Этьену Lefai, Stéphanie Chanon и Hubert Видал (INSERM, Лион) для подготовки первичных миобластов человека; и Доменико Боско и Тьерри Berney (Островок центра трансплантации человека, Женева Больница университета) для обеспечения человека островки. Эта работа была профинансирована N: Швейцарский национальный научный фонд Грант 31003A_146475 / 1, Sinergia Швейцарский национальный научный фонд грант № CRSII3-154405, Fondation Romande пур ля Recherche сюр Diabète, Бо Hjelt Foundation, Fondation Ernst Et Lucie Шмидхайни и Société Académique De Geneve (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
