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생화학

Une méthode pour l'ARN de mesure<em> N</em<sup> 6</sup> -methyladenosine Modifications dans les cellules et de tissus

Published: December 05, 2016
doi:
10.3791/54672
, ,
1Department of Cardiology,Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

Une méthode Northern Blot modifiée pour mesurer N6- -methyladenosine (m 6 a) des modifications dans l' ARN est décrite. La méthode actuelle peut détecter des modifications dans divers ARNs et des contrôles en vertu de divers modèles expérimentaux.

Abstract

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N6-methyladenosine (m6A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes1. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA2. The m6A modifications of mRNA influence their splicing3, translation4, degradation5, and localization2. Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function6. The evolutionary conservation of m6A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans7. Delineation of the roles of m6A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA8 also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms9, stem cell pluripotency10, triglyceride metabolism4, fibrosis11, obesity12, and major depression13 are a few examples of processes where m6A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m6A sites14. Modulation of m6A methylase or demethylase elicits circadian period changes15. Mettl3, an m6A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage10. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m6A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl44. These studies reveal that m6A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m6A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m6A modifications of RNA16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m6A in several RNAs19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m6A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry21. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m6A-Seq)22 immunoprecipitates fragmented RNAs with m6A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m6A landscapes. High-resolution mapping of m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m6A modifications at a single-nucleotide resolution23. Both methods provide details of m6A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m6A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m6A levels. To detect global m6A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis18. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m6A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

NOTE: Le m d'ARN total 6 Un niveau comprend l' ARNr, l' ARNm, et d' autres petits ARN. Depuis l' ARN ribosomal a abondant m 6 modifications A, la mesure de m 6 niveaux A devront tenir compte de ce fait. 1. Isolement de l'ARN En utilisant la solution ribonucléase de décontamination (pulvérisée sur des serviettes en papier), essuyez les pipettes et les surfaces de laboratoire de banc. serviettes en papier humides avec de l'eau sans nucléase et essuyez pipettes et des surfaces de laboratoire de banc à nouveau. Extraction d'ARN Isolement de l'ARN total En utilisant un agitateur suspendu, d' homogénéisation de 50 à 100 mg de tissu ou de 5-10 x 10 6 cellules dans 1 ml de solution d'isolement d'ARN maintenu à 4 ° C. NOTE: Plus le tissu (100-150 mg) peuvent être nécessaires pour des échantillons de tissu adipeux de souris en raison des concentrations d'ARN inférieures qui y sont. Les échantillons proviennent de coeur de la souris, le foie, le muscle squelettique, du poumon, du cerveau, et les macrophages ont été employées précédemment 4. Danscubate homogénats d'échantillons pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 100 ul de 1-bromo-3-chloropropane (PCA) pour 1 ml d'échantillon d'homogénat. Agiter les tubes vigoureusement pendant 15 s et procéder à isoler l' ARN total selon les instructions du fabricant 24. Polyadénylé de purification d'ARNm de l'ARN total isolé Purifier ARNm polyadénylés à l'aide de kits ou protocoles disponibles. Bien agiter pour remettre en suspension chacune des solutions suivantes: solution de liaison, oligo (dT) des billes de polystyrène, et une solution de lavage 2x. Assurez-vous que l'oligo (dT) Perles réchauffer à la température ambiante avant utilisation. Transférer 120 pi de solution d'élution par préparation dans un tube et on chauffe à 70 ° C dans un bloc chauffant. Pipeter jusqu'à 500 pg d'ARN total dans un tube de microcentrifugation. Avec de l'eau sans nucléase, ajuster le volume à 250 pi. Ajouter 250 pi de solution de liaison 2x à l'ARN total ainsirésolu- et brièvement vortex pour mélanger le contenu. Ajouter 15 ul d'oligo (dT) et des billes vortex pour mélanger à fond. Laisser incuber le mélange à 70 ° C pendant 3 min. Retirer l'échantillon du bloc de chauffage et le laisser reposer à température ambiante pendant 10 min. Centrifuger à 15000 g pendant 2 min. Retirez délicatement le surnageant, laissant environ 50 pi. Ajouter 500 pi de solution de lavage pour resuspendre le culot par pipetage. Pipeter la suspension dans un tube ensemble filtre rotatif / collection. Centrifuger à 15000 g pendant 2 min. Retirer la colonne du tube collecteur et jeter l'écoulement. Retour à la colonne du tube de collecte. Pipette 500 pi de solution de lavage sur le filtre de spin. Centrifugeuse à 15.000 x g pendant 2 min. Transférer le filtre rotatif dans un tube de collection fraîche. Introduire à la pipette 50 ul de solution d'élution chaufféà 70 ° C sur le centre du filtre rotatif. Incuber pendant 2-5 min à 70 ° C. Centrifuger à 15000 g pendant 1 min. Pipeter une 50 ul supplémentaires de solution d'élution chauffé à 70 ° C sur le centre du filtre rotatif. Répétez l'étape 1.2.2.1.18. Ajouter 100 pg / ml de glycogène, 0,1 volume de 3 M de tampon d'acétate de sodium (pH 5,2) et 2,5 volumes d'éthanol absolu. Précipiter nuit à -80 ° C. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 25 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 75%. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirez délicatement l'éthanol. Sec à l'air pendant 3-5 min. Ajouter 10 ul d'eau sans nucléase pour dissoudre le culot. Conserver à -70 ° C. ARN Qualification et quantification À l'aide d'un spectrophotomètre, déterminer la concentration d'ARN par Notlng l'absorbance à 260 nm et 280 nm. Le rapport A 260 / A 280 devrait être de 1,8 à 2,2. Vérifier la qualité de l' échantillon d'ARN en utilisant 0,8% de gel d' agarose électrophorèse 25. NOTE: L'ARN total eucaryote intact devrait montrer intenses bandes 28S et 18S. Le rapport de 28S par rapport 18S intensité de la bande pour une bonne préparation de l'ARN est ~ 2. 2. Gel Electrophoresis et le transfert REMARQUE: Les protocoles de préparation de tampon sont donnés dans le tableau 1. Préparation du gel de formaldehyde (1%) Rincer tout l'équipement d'électrophorèse avec de diéthyle (DEPC) l'eau. Faire fondre 2,5 g d'agarose dans 215 ml d'eau DEPC complètement dans un four à micro-ondes. Ajouter 12,5 ml de 10x 3- (N- morpholino) propanesulfonique (MOPS) tampon et 22,5 ml de 37% de formaldéhyde. Verser dans l'appareil d'électrophorèse avec un peigne à une épaisseur de 1,5 mm. Éliminer les bulles ou pousser tourlet sur les bords du gel avec un peigne propre. Permettre au gel de se solidifier à la température ambiante. La préparation des échantillons Mélanger 1-10 ug de l'ARN total et 11,3 ul de tampon d'échantillon. Mélanger 2 pg du marqueur d'ARN (1 pg / pl) 11,3 pi de tampon d'échantillon. Ajouter de l'eau sans nuclease à partir des échantillons 2.2.1 et 2.2.2 à un volume total de 16 ul. Chauffer à 60 ° C pendant 5 min, puis refroidir sur la glace. Mélanger 16 ul de l'échantillon à partir 2.2.3 avec 4 pi de colorant de suivi, qui contient 0,1 pg / pl de bromure d'éthidium sur la glace. ATTENTION: Le bromure d'éthidium est peut-être tératogène et toxique en cas d'inhalation. Lire le bromure d'éthidium fiche de sécurité. Electrophorèse Ajouter 200 ml de 10x MOPS tampon à 1.800 ml de ddH 2 O pour faire un tampon de migration MOPS 1x. Utilisez le tampon en cours d'exécution 1x MOPS pour rincer les puits du gel. Pre-run til gel à 20 V pendant 5 min. Charger les échantillons d'ARN dans les puits du gel. Couvrir de papier d'aluminium pour éviter exposition à la lumière. Exécutez à 35 V pendant environ 17 h (pendant la nuit) Examiner et photographier le gel sous une lumière UV. Transfert Couper le gel pour éliminer la portion inutilisée. Préparer 500 ml de 10 x tampon SSC (250 ml de tampon 20x SSC et 250 ml d'eau DEPC). Laver le gel deux fois avec un tampon 10x SSC pendant 20 minutes avec agitation à 50 tours par minute. Couper 1 filtre feuille de papier assez grand pour servir de document de mèche, qui absorbe un tampon de transfert à partir du plateau de transfert (Figure 1). Couper 4 morceaux de papier filtre à la même taille que le gel. Découper une feuille de membrane en nylon chargée positivement à la même taille que le gel. Marquer une encoche sur le gel et la membrane en tant que marqueur pour assurer l'orientation correcte. Faire tremper la membrane dans un tampon SSC 2x pendant 15 min. Verser 500 ml d'of 10x SSC tampon dans le bac de transfert. Poser la grande feuille de papier filtre sur la plaque de verre et le papier filtre humide avec un tampon de transfert. Etaler les bulles avec une pipette. Faire tremper 2 morceaux de papier filtre pré-découpé dans un tampon de transfert et les placer sur le centre du papier filtre de l'étape 2.4.5. Retirez toutes les bulles. Poser le côté supérieur de gel sur le papier filtre. Poser la membrane sur le dessus du gel. Aligner les encoches du gel et la membrane. Placer 2 morceaux de papier filtre pré-coupe sur le dessus de la membrane et le papier filtre avec un tampon de transfert humide. Retirez toutes les bulles entre les couches. Appliquer un film plastique autour du gel pour assurer que les serviettes seulement absorbent le tampon qui passe à travers le gel et la membrane. Empilez les serviettes en papier sur le dessus du papier filtre. Placer une plaque de verre surdimensionné sur le dessus des serviettes. Placer un poids sur le dessus de la pile. Maintenir pendant une nuit pour permettre à l'ARN de transférer du gel vers la membrane. 3. Détection de la N 6 -methyladenosine Membrane Réticulation Gardez la membrane humide dans un tampon 2x SSC. Placez 2 feuilles de papier filtre immergé avec 10x tampon SSC en réticulant UV. Placer la membrane sur le dessus du papier-filtre, le côté de l'ARN adsorbé vers le haut. Sélectionnez "mode autocrosslink" (120.000 pJ) et appuyez sur le bouton "Démarrer" pour lancer l'irradiation. Examiner la membrane et le gel avec un gel UV image receveur pour confirmer le transfert de l'ARN du gel à la membrane. immunotransfert Bloquer la membrane dans 5% de lait dégraissé dans une solution salée tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST), un tampon à température ambiante pendant 1 h. Laver trois fois avec du tampon TBST pendant 15 min. Incuber la membrane pendant une nuit à 6 m A (<em> N 6 -methyladenosine) solution d'anticorps (1: tampon TBST de lait non gras 1000 dans 5%) à 4 ° C. Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min. Incuber la membrane dans la solution d'âne conjugué à HRP anti-lapin d'anticorps (1: 2000 dans du tampon TBST de lait non gras à 5%) pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min. Appliquer le substrat de chimioluminescence amélioré (0,125 ml par cm2 de membrane). Capturez la chimioluminescence avec les réglages optimaux de l'imageur numérique, selon les instructions du fabricant 26. m 6 A Quantification Mesurer la m 6 Une intensité de chimioluminescence par rapport à l' aide du logiciel ImageJ. Dans le menu du logiciel ImageJ, sélectionnez l'option "Fichier" pour ouvrir le fichier pertinent. Sélectionnez l'outil "Rectangle" de ImageJ et dessiner un cadre autourles signaux. Si l' ARN ribosomal est pas l'objet des expériences, d' éviter les 18S et 28S ribosomal RNA m 6 bandes A pour le calcul. Cliquez sur "Command" et "1" pour confirmer la voie sélectionnée. Appuyez sur "commande" et "3" pour afficher le tracé sélectionné. Cliquez sur l'outil "Straight" et tracer des lignes pour séparer la zone segmentée. Cliquez sur l'outil "baguette" pour enregistrer les mesures. Exporter les données. Normaliser les niveaux de m 6 A avec l'ARN ribosomal 18S bande à partir de la coloration au bromure d'éthidium.

Representative Results

Après 14 jours en phase circadienne de lumière-obscurité normale, les souris de type sauvage ont été placés dans l'obscurité constante. Les ARN du foie ont été prélevés à des intervalles de 4 h et étudiés avec Northern Blot modifiée. La méthylation des ARNr, d' ARNm et de petits ARN ont été clairement détectée (figure 2). La comparaison entre les différents moments circadiens (CT) peut être calculé avec précision le niveau ARNr 18S. Il était robuste oscillation circadienne de m 6 niveaux A à ARNr, l' ARNm, et les petits ARN. Afin d'éviter l'interférence avancé par un ARNr, un ARN polyadénylés peuvent être purifiés comme à l'étape 1.2.2. Après purification, le rARN peut être largement éliminé pour permettre une meilleure visualisation des autres ARN (figure 3). <stron g> Figure 1: Montage de l'unité de transfert de blot. L'unité de transfert capillaire pour buvard l'ARN sur la membrane est représentée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: le rythme circadien des m 6 niveaux A à C57BL / 6J. Cette figure montre la m 6 Un transfert de l' ARN total à partir de foies de souris de type sauvage a sacrifié le premier jour de la phase sombre sombre après 14 jours d'une phase de lumière-obscurité normale à 4 heures d' intervalle. La quantification a été effectuée en utilisant les 6 m Une différence de densité d'image entre rARN 18S et 28S. M 6 Une abondance a été étalonnée par rapport à la bande 18S du gel de formaldehyde au fond.et = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: m 6a blots avec ou sans ARNr. M représentant 6 A blot de l' ARN total et de l' ARN polyadénylé à partir de foies de souris de type sauvage sont présentées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 1 tampon 10x MOPS (pH 7,0, protéger de la lumière) MOPS 41.85 g 0,2 M L'acétate de sodium 4.1 g 0,05 M EDTA, le sel de disodium 3.7 g 0,01 M l'eau DEPC Total 1 L On agite à la température ambiante 2 tampon de SSC 20x (pH 7,0) Chlorure de sodium 175,3 g 3 M Citrate trisodique 88,3 g 0,3 M l'eau DEPC Total 1 L </td> Agiter à la température ambiante, puis l'autoclave 3 Dye Suivi tampon 10x MOPS 500 ul 1 fois Ficoll 400 0,75 g 15% bleu de bromophénol 0,01 g 0,2% Xylène Cyanol 0,01 g 0,2% l'eau DEPC Total 5 mL Conserver à -20 ° C 4 l'eau DEPC Diluer ratio à 1: 1.000 de DEPC dans ddH 2 O Agiter pendant une nuit à température ambiante, puis l'autoclave 5 tampon d'échantillon (abri de la lumière) tampon 10x MOPS 200 ul 37% de formaldéhyde 270 ul formamide 660 ul Conserver à -20 ° C </tbody> Tableau 1: Tampons et solutions.

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded8. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications27.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m6A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA22. It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m6A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult18. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m6A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing30. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control31. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

C.Y.W. received support from the National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), the National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009), and Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091, and CMRPG3C1763).

Materials

RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll 400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8
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RNA N6-methyladenosineRNA EpigeneticsNorthern BlottingRNA ModificationsN6A DetectionRNA IsolationAgarose Gel ElectrophoresisMOPS BufferFormaldehydeSSC BufferRNA Transfer

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Wang, C., Lin, M., Su, H. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).
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