Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

1. Bereid de scFv bibliotheek als een fusie met het ssTorA Signal Sequence Zorg voor een deoxyribonucleïnezuur (DNA) bibliotheek met varianten van een scFv-gen. OPMERKING: De bibliotheek kan ook gemaakt worden met behulp van een geschikte wijze om diversiteit in het gehele scFv gen of gerichte domeinen genereren 22 (bijvoorbeeld het derde complementariteitsbepalende gebieden, CDR3.). Plaats de DNA-bibliotheek in de EMB plasmide (figuur 2) onder toepassing van standaard moleculaire kloneringswerkwijzen 23. Opmerking: Dit plasmide brengt scFvs als een genetische fusie met het ssTorA signaalsequentie (N-terminaal scFv) en de FLAG-epitoop-tag (C-terminal naar het scFv). Het ontwerp van het plasmide voor binnenmembraan weergave is eerder 19 beschreven. De EMB plasmide is verkrijgbaar bij de auteurs. <br/> Figuur 2. Binnen membraan weergave plasmide (EMB) kaart (stap 1,2 tot 1,3). Dit plasmide bevat een lac-promotor, oorsprong van replicatie ColE1 en een chloramfenicol resistentiegen. De ingevoegde scFv gen wordt gefuseerd aan het ssTorA signaalsequentie de scFv richten op de Tat pathway en een FLAG epitoop tag, met alle drie in hetzelfde leesraam. Restrictie-enzymplaatsen worden aangegeven. Een bibliotheek ingevoegd tussen de Xbal en Notl restrictie-enzymplaatsen, de grootte van het plasmide 2219 bp plus de grootte van het scFv. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. Transformeer het plasmide DNA dat de bibliotheek in MC4100 E. coli cellen 23. Herstellen en te groeien deze bacteriële vorm van de bibliotheek. Centrifugeer bij 4000 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te verzamelen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de verzamelde cellenin 25% glycerol in Luria-Bertani (LB) media. Store fracties bij -80 ° C totdat het nodig is, of gaat u naar stap 2. LET OP: Het protocol is geverifieerd met MC4100 cellen, hoewel andere E. coli-stammen wordt ook verwacht dat compatibel is met het protocol te zijn. Elektroporatie is de voorkeurswerkwijze voor transformatie, vanwege de hoge transformatie-efficiëntie. De bibliotheek zal kenmerkend bestaan uit ten minste 10 9 scFv varianten in dit stadium en elk aliquot moet voldoende cellen bevatten, die de bibliotheek onder 100-voudig. 2. Druk de Bibliotheek en Bereid Sferoplasten Dooi een hoeveelheid van de bacteriële bibliotheek (van stap 1,3) bij kamertemperatuur en voeg het monster aan een kolf die 100 ml LB medium met 20 ug / ml chlooramfenicol (Cm). Groeien 3 uur bij 37 ° C en 225 rpm in een schudder geïncubeerd. Na 3 uur, verwijder de kolf uit de 37 ° C geïncubeerd shaker. Sta expressie van het scFv bibliotheekdoorgaan O / N voor 15 tot 22 uur bij 20 ° C en 225 rpm in een schudder geïncubeerd. LET OP: geen inductor is nodig bij gebruik van de EMB plasmide, als promotor is lekkende. Merk op dat MC4100 cellen niet overexpressie het Lac repressor (en Lacl wordt niet gevonden op het plasmide). Figuur 3. E.coli cellen en sferoplasten. (A) E. coli cellen zijn cilindrisch van vorm. (B) Na spheroplasting gebruik EDTA en lysozym, het buitenmembraan van E. coli cellen bezwijkt en de resulterende sferoplasten zijn bolvormig. Differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie beelden werden verkregen met een 100x objectief op een omgekeerde microscoop. Zoom clik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Bereid de bibliotheek sferoplasten. OPMERKING: Sferoplasten worden gevormd door het scheuren van de buitenmembraan van E. coli en zijn bolvormig (Figuur 3). Bereid de benodigde buffers. OPMERKING: Alle buffers moeten steriel zijn. Bereid 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door het oplossen van 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2PO 4 in gedestilleerd H 2 O tot een eindvolume van 1000 ml. Houd op het ijs. Bereid PBS met 0,1% (w / v) bovine serum albumine (BSA) door het oplossen van 0,2 g BSA in 200 ml 1 x PBS. Houd op het ijs. Bereid de fractionering buffer (FB) door mengen van 7,5 ml steriel gefiltreerde 1 M sucrose, 1 ml 1 M Tris buffer (pH 8,0) en 1,5 ml gedestilleerd H 2 O. Houd op het ijs. Bereid 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) door toevoeging van 30 ul of 0,5 M EDTA tot 14,97 ml gedestilleerd H 2 O. Bereid 0,5 M MgCl2 door oplossen 4,76 g MgCl 2 in 100 ml gedestilleerd H 2 O. Houd op het ijs. Neem de kolf uit de schudinrichting en meet de optische dichtheid (OD) bij 600 nm met een spectrofotometer om de celdichtheid te bepalen. Bereken de hoeveelheid geïnduceerde kweek nodig zodat elk monster spheroplasting heeft 1 x 10 10 cellen. OPMERKING: De benadering van een OD 600 van 1 wijst op een concentratie van 10 9 cellen / ml voor E. coli kan worden gebruikt 24. Centrifugeer de berekende hoeveelheid geïnduceerde kweek in een 1,5 ml microcentrifuge buis bij 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Maak minstens twee monsters indien een vraagstuk met monstervoorbereiding. Verwijder het supernatant van de kweken gecentrifugeerd en resuspendeer elke cel pellet in 100 ul ijskoude FB. Centrifugeer bij 12.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en verwijder het supernatant door pipetteren. Resuspendeer elk pellet in 350 pl ijskoude FB aangevuld met 3,5 pl van 10 mg / ml lysozym. vortex langzaam elke buis onder toevoeging druppelsgewijs 700 ui 1 mM EDTA, en incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten onder langzaam draaien op een buis rotator om de monsters te mengen. Verwijder de buizen uit de rotator, voeg 50 ul ijskoude 0,5 M MgCl2 aan elke buis en incubeer ze op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer de buizen bij 11.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Isoleer de sferoplast pellet. Gebruik een micropipet met een tip 1 ml langzaam omhoog te trekken deel van pellet. Terwijl de buis onder een hoek met de opening direct boven een nieuwe 1,5 ml buis, Til de pipetpunt uit de supernatant en schuif de pellet in de nieuwe buis. Als een aanzienlijke hoeveelheid supernatant wordt overgebracht naar de nieuwe buis, verwijdert u deze door pipetteren. Als de pellet is niet stevig enough over te dragen, re-centrifuge bij 11.000 xg gedurende 2 minuten en poging pellet isolatie weer. Resuspendeer de pellet in sferoplast elke buis 1 ml ijskoude 1 x PBS. Alternate tussen pipetteren en langzaam vortexen op een vortex houder totdat de pellet volledig geresuspendeerd. Niet monsters afhouden van het ijs langer dan 2 minuten per keer, en terugkeren naar de ijs gedurende ten minste 5 minuten voor het verwijderen van het ijs opnieuw. Houd de sferoplasten bij 4 ° C (gedurende maximaal 2 dagen) tot gebruik voor panning in stap 4. 3. Immobiliseer het doelantigeen op Magnetic Beads Biotinyleren het doelantigeen in vivo tijdens recombinante productie in E. coli-cellen. U kunt ook gebruik maken van chemische conjugatie 25 of de aankoop doelwitantigeen die al is gebiotinyleerd, en ga verder met stap 3.2. Voeg 816 g bicine tot 50 ml water tot 10 × bicine buffer te maken. Verdun de buffer tot 1 x met gedestilleerd H2O en verhit tot 50 ° C. Voeg 14,7 mg biotine aan 12 ml van de verwarmde 1 × bicine buffer tot een biotine oplossing die 5 mM biotine in 10 mM bicine buffer maken. Bewaren bij -20 ° C totdat het nodig is. Drukken en biotinyleren het doeleiwit met de pAK400cb-BCCP plasmide 26, die de productie van het doelantigeen maakt als fusie met het biotine carboxyl dragereiwit (BCCP). LET OP: E. coli cellen native biotinyleren BCCP, waardoor de noodzaak om te zuiveren en chemisch biotinyleren het doeleiwit voorafgaand aan immobilisatie op met streptavidine beklede parels. De inheemse E. coli biotineligase BirA volstaat biotinyleren het fusie-eiwit. Grow E. coli die het biotinylatie plasmide (met het doelantigeen ingevoegd als een fusie aan het N-uiteinde van BCCP) O / N 15 tot 18 uur in 5 ml LB medium aangevuld met 20 ug / ml Cm bij 37 ° C onder schudden bij 225 rpm. Meet de OD bij 600 nm onder toepassing van een spectrofotometer en het berekenen van de hoeveelheid kweek nodig (V add) aan subcultuur in een startende OD van 0,05 in 25 ml vers LB-medium met 20 ug / ml Cm met de vergelijking: voeg = (0,05 x 25 ml) / (OD 600-0,05), waarbij 600 OD de optische dichtheid van de O / N kweek en add V het volume van de O / N kweek toe te voegen aan de verse LB. Subcultuur en groeien tot een OD van 0,5-0,8 per geïncubeerd schudinrichting bij 37 ° C en 225 rpm. Add isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside tot een uiteindelijke concentratie van 100 pM en biotine tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM. Induceren expressie in een schudinrichting geïncubeerd 15 tot 22 uur bij 20 ° C en 225 rpm. Oogst bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant. Bewaar de pellet bij -20 ° C tot aan gebruik. Toevoegen1 ml van een cel lysis detergens per 0,2 g celpellet. Resuspendeer door pipetteren en voorzichtig zwenken gedurende 20 minuten om de cellen te lyseren. Na lysis, centrifugeer bij 16.000 xg en 4 ° C gedurende 20 min. Pipetteer de oplosbare lysaat (supernatans) in een nieuwe 1,5 ml buis. Gebruik een 3 kDa moleculair gewicht cutoff kolom om de niet-gebonden biotine verwijderen. Pipetteer het lysaat in de kolom en centrifugeer bij 20 ° C volgens de instructies van de fabrikant. Wassen met 1 x PBS tot het biotine in het lysaat werd 100-voudig verdund en het volume van het gewassen lysaat is gelijk aan het oorspronkelijke volume van het lysaat. Breng het lysaat naar een nieuwe buis. Immobiliseer het gebiotinyleerde doelantigeen op met streptavidine beklede magnetische korrels. Bereid 1 x PBS en 1 x PBS met 0,1% (w / v) BSA zoals beschreven in stap 2.3.1. Bereid de magnetische bolletjes. Opmerking: Dit vereist het gebruik van een magnetisch scheidingsrek. Resuspendeer streptavidin-gecoate magnetische korrels in het oorspronkelijke buisje. Hetzij vortex gedurende ten minste 30 seconden of roteren gedurende 5 min. Transfer 7-10 x 10 9 kralen aan een 1,5 ml buis. Opmerking: Het volume dat nodig is afhankelijk van de kraal concentratie door de fabrikant zijn. Plaats de buis met de kralen op de magneet rek voor 2 minuten om de kralen te verzamelen over de zijkant van de buis. Met de buis nog steeds op de magneet, verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren zonder verstoring van de kralen. Te wassen, verwijdert u de tube van de magneet, en resuspendeer de kralen in 1 ml van 1 x PBS door pipetteren zonder het genereren van bubbels. Zet de buis naar de magneet voor 2 min om de kralen te verzamelen, en verwijder voorzichtig de supernatant door pipetteren. Herhaal dit proces nog twee keer voor een totaal van drie wassingen. Zorg ervoor dat er geen vloeistof overblijft in de buis na de laatste wasbeurt. Voeg het lysaat met het gebiotinyleerde antigeen aan de magnetische beads. Haal de buis uit de magneet en resuspendeer de kralen in 1 ml lysaat (uit stap 3.1.5). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min onder zachtjes draaien. Plaats de buis op de magneet gedurende 3 min bij de antigeen beklede parels te verzamelen. Was de beklede korrels vijf maal met 1 x PBS met 0,1% BSA op dezelfde wijze als beschreven in stap 3.2.2.3 tot 3.2.2.4. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 1 x PBS met 0,1% BSA tot hetzelfde volume gebruikt in stap 3.2.2.2. Als het geïmmobiliseerde doelantigeen stabiel is bij 4 ° C, bewaar de beklede korrels bij 4 ° C totdat het nodig is voor panning. Anders gaat u naar stap 4. 4. Scherm het scFv bibliotheek door panning tegen de Target Antigen (figuur 4) Figuur 4. Panning (Stap 4). Antigeen-beklede magnetische korrels are geïncubeerd met sferoplasten expressie antilichaambibliotheek varianten. Plasmide DNA uit bead-gebonden sferoplasten wordt teruggewonnen en gebruikt om een ​​sub-bank die wordt gescreend met de ELISA-gebaseerde secundaire screening genereren. Overeenkomstige protocol stappen worden genoteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Incubeer de beklede kralen met sferoplasten. Gebruik een sferoplast verhouding van ongeveer 5 parel: 1. Voeg 4 x 10 9 sferoplasten en 8 x 10 8 kralen in een steriele 15 ml buis. OPMERKING: Stel dat geen cellen werden verloren tijdens de spheroplasting proces, zodat de concentratie nog 1 x 10 10 sferoplasten / ml. Voeg 1 x PBS met 0,1% BSA om het totale volume 4 ml wordt. Aliquot in vier 1,5 ml buizen met elk 1 ml. Incubeer de reacties bij 4 ° C gedurende 5 uur onder zachtjes draaien. Prepare de kraal gebonden sferoplasten voor polymerasekettingreactie (PCR). Plaats de panning reageerbuisjes op de magneet gedurende 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren, en was de kraal gebonden sferoplasten vier maal met ijskoude 1 x PBS met 0,1% BSA op dezelfde wijze als beschreven in stap 3.2.2.3 tot 3.2.2.4. Resuspendeer de kraal gebonden sferoplasten in elke buis in 25 pl gedestilleerd H2O Bewaar de kralen bij -20 ° C of ga verder met stap 4.3. Voer gehele plasmide-PCR on-bead gebonden sferoplasten de plasmiden die de genen voor bead gebonden scFvs amplificeren. Het verkrijgen van primers met de volgende sequenties: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 '(voorwaartse primer) en 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3' (reverse primer). Opmerking: Deze zullen end-to-end op tegenoverliggende strengen van de EMB plasmide (figuur 2) binden en zijn ontworpen om te hybridiseren een gemeenschappelijk kenmerk van EMB, zodat amplificatie optreedt ongeacht descFv variante sequentie. Fosforyleren de primers. OPMERKING: Zonder fosforylering, herligatie zal optreden. Primers kunnen ook worden besteld met 5'-fosforylering, in plaats van het gebruik van deze methode fosforylering in dit protocol. In een 0,5 ml buis opstelling een fosforyleringsreactie de voorwaartse PCR-primer zoals beschreven in tabel 1. Herhaal deze procedure voor de tegengestelde primer. Incubeer de reacties bij 37 ° C gedurende 1 uur. incubeer ze vervolgens bij 65 ° C gedurende 20 minuten om de T4 polynucleotidekinase (PNK) deactiveren. Bewaar de gefosforyleerde primers bij -20 ° C. PCR uitvoeren. In een PCR buis Maak de PCR zoals beschreven in tabel 2. LET OP: Meerdere reacties kunnen voorbereid voor een hogere opbrengst zijn. Het ongebruikte bead-gebonden sferoplasten kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C. Verwarm de PCR reacties bij 98 ° C gedurende 15 min in een thermische cycler voor volledige lysis te verzekeren van de sferoplasten. Verwijder de buizen uit de thermische cycler en voeg 0,5 pl van een high fidelity polymerase elk. Terugvoerbuizen de thermische cycler en start met het programma in Tabel 3. Verzamel de PCR producten geschikt. Bewaar bij -20 ° C of ga verder met stap 4.4. Tabel 1. PNK fosforyleringsreactie (Stap 4.3.2.1). Reagens Volume (pl) Gedestilleerd H 2 O 15 10x T4 DNA ligase reactiebuffer 2 100 pM primer 2 T4 polynucleotidekinase (PNK) 1 ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-met-next.within-page =" always "> Tabel 2. Whole-plasmide PCR-reactie (Stap 4.3.3.1). Reagens Volume (pl) Gedestilleerd H 2 O 28.5 5x High-fidelity polymerase buffer 10 10 M Gefosforyleerd voorwaartse primer 2.5 10 uM gefosforyleerde reverse primer 2.5 40 mM dNTP mix (10 mM elk dNTP) 1 -Bead gebonden sferoplasten 5 Tabel 3. PCR-programma (Stap 4.3.3.2). <tbody> Stap Temperatuur (° C) Tijd (min: sec) Aantal cycli Initial denatureren 98 00:30 1 denatureren 98 00:10 35 gloeien 69 00:30 Uitbreiding 72 00:30 per kb laatste verlenging 72 06:00 1 Greep 12 Eindeloos 1 Opnieuw circularize heel plasmide-PCR producten en het gebruik geligeerd product te transformeren MC4100 E. coli-cellen. Zuiver het PCR-product door het uitvoeren van de PCR-reactie op een agarosegel 23, kleuring van het DNA in de gel 23, en met eengel cleanup kit om de gelineariseerde plasmide zuiveren volgens de door de fabrikant geleverde instructies. Meet de concentratie onder toepassing van een spectrofotometer bij 260 nm. Bewaar het gezuiverde fragment bij -20 ° C totdat het nodig is, of ga verder met stap 4.4.2. Opnieuw circularize plasmide uit het PCR-product. Intermoleculaire ligatie van het PCR-product te voorkomen, voert de ligatiereactie met een lage concentratie 27 van 1 ng / ul PCR product. Bereken het volume nodig voor het bereiden van een 800 gl ligatiereactie bij deze concentratie. Bereid de ligatiereactie op ijs. In een buis, voeg het volume berekend in stap 4.4.2.1 van het PCR product, 80 pi 10 x DNA ligase buffer en gedestilleerd H 2 O tot 800 pl. Voeg 4 pi T4-DNA-ligase, en zij plaatst buizen bij 16 ° C in een waterbad of thermische cycler. Incubeer bij 16 ° CO / N voor 14 tot 18 uur. Bewaar de voltooide ligatiereacties bij -20 ° Ctotdat het nodig is, of ga verder met stap 4.4.3. Plaats de ligatie reactie op een verwarmingsblok bij 65 ° C gedurende 15 minuten aan hitte-inactiveren DNA ligase. Maak dan gebruik van een microdialyse membraan of DNA opruimen kit om de-zout het geligeerde DNA. Bewaren bij 20 ° C of ga verder met stap 4.4.4. Gebruik de gehele warmte geïnactiveerd,-de gezouten ligatieproduct te transformeren MC4100 E. coli cellen 23. Bereiden glycerol voorraden, zoals beschreven in stap 1.3, van de cellen met de resulterende gepand subbank en bewaar monsters bij -80 ° C. Herhaal stap 4 in zijn geheel met een bekende hoeveelheid uit stap 4.4.4 een tweede panning op de subbank doen. NB: Een tweede panning helpt verrijken bibliotheek bestanddelen die goed binden aan het doelantigeen 19. 5. Voer een tweede scherm met behulp van een Enzyme-linked immunosorbent assay methode om veelbelovende klonen voor verdere karakterisering identificeren (Figuur 5) </P> Figuur 5. ELISA-gebaseerde secundaire screening (Stap 5). (A) bibliotheek varianten van de subbank verrijkte tijdens panning geïnoculeerd in afzonderlijke putjes van een kweekplaat voor groei en expressie. (B) Een ELISA plaat gecoat met doelantigeen. (C) De bibliotheek varianten worden gescreend met behulp van de ELISA-gebaseerde secundaire scherm in het protocol beschreven. Na analyse van de gegevens die zijn verkregen uit de secundaire scherm, zijn varianten van belang geselecteerd en gekarakteriseerd verder. Overeenkomstige protocol stappen worden genoteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Dooi een buis van de gepand subbank (uit stap 4.4.4) en de plaat op LB agarplaten. Plate verschillende verdunningenbij concentraties zo laag zijn individuele kolonies (bijvoorbeeld 10 2 – 6 tot 10-voudige verdunningen). Incubeer de platen gedurende 15-18 uur bij 37 ° C. Bewaar de platen bij 4 ° C of ga verder met stap 5.2. Cultuur en induceren kolonies van de gepand subbank. Voer alle stappen onder steriele omstandigheden. Gebruik een multichannel pipet te stappen met 96 putjes. Voeg 200 gl LB met 20 ug / ml Cm in elk putje van een ronde bodem 96-well kweekplaat. Kies een individuele kolonie van de agarplaat met een pipetpunt, plaats de tip in het eerste putje van de 96-well plaat en Roer inoculeren. Gebruik een nieuwe tip voor elk putje. Inoculeren een kolonie in elk putje. Als controle, ten minste één steriliteit controleputje zonder kolonie geïnoculeerd. Herhaal stap 5.2.1 en 5.2.2 tot enkele 96-well platen te enten. Plaats de 96 putjes op een microplaat schudinrichting bij 310 rpm. Incubeer bij 376; C gedurende 20 tot 24 uur om de scFvs te drukken. Voor elke cultuur plaat bereid in stap 5.2, jas een 96-well ELISA plaat met het doelantigeen. Verdun gezuiverd doelantigeen tot een geschikte concentratie (bijvoorbeeld 1 ug / ml tot 4 ug / ml) in 1 x PBS om de bekledingsoplossing maken. Voeg 5 ml bekledingsoplossing per 96-well plaat. OPMERKING: De juiste concentratie is afhankelijk van het antigeen worden gebruikt en moet worden aangepast. Voeg 50 ul van de bekledingsoplossing aan elk putje van een 96 putjes hoogbindende clear polystyreen ELISA-plaat. klop de plaat op het stationaire oppervlak zodat het gehele oppervlak van elk putje is bekleed. Herhaal dit voor elke plaat. Incubeer de platen bij 4 ° CO / N. Kopie van de kolonies van de 96 putjes op agar platen. Plaats een steriele polystyreen replicator in de putjes van een kweekplaat met een kleine hoeveelheid vloeibare zee verzamelenid. Til de replicator en over te dragen aan een 15 cm LB-agar plaat zodanig dat alle tips de plaat raken. Zodra de vloeistof heeft overgedragen, til de replicator recht omhoog. Herhaal dit voor elke cultuur plaat. Label de agar plaat met de correcte oriëntatie, zodat de resultaten van het tweede scherm in de 96-well plaat kan worden gekoppeld aan de juiste gerepliceerde kolonie op de plaat of verdere karakterisering gewenst. Groeien bij 37 ° C gedurende 15 tot 18 uur, en bewaar bij 4 ° C totdat het nodig is. Voer de secundaire scherm ELISA. Bereid de blokkerende oplossing door 2% (w / v) melkpoeder in 1 x PBS. Leeg de bekledingsoplossing van de ELISA-platen. Voeg 100 ul van de blokkerende oplossing aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur, of blok O / N bij 4 ° C. Bereid de wasbuffer door het toevoegen van polysorbaat 20 om een ​​eindconcentratie van 0,05% in 1 x PBS. Maak 250 ml per ELISA-plaat. Voeg 20 ul van eengeconcentreerd cellysis wasmiddel aan elk putje van de ronde-bodem kweekplaat, en incubeer de petrischaal op een microplaat schudinrichting bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 20 minuten. Begin de lysis tegelijkertijd dat het blokkeren van de ELISA-platen is voltooid, zodat de lysis en de wasstap 5.5.4 gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd. Leeg de blokkerende oplossing uit de ELISA-platen. Was de geblokkeerde ELISA-platen vier keer met 200 ui wasbuffer per well per wasbeurt. Leeg de wasbuffer uit de putjes. Breng 50 pl van elk putje van de cellyse plaat om de overeenkomstige putje van de ELISA plaat, met een nieuwe tip voor elk putje. Incubeer de ELISA plaat bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. Bereid het antilichaam oplossing voor gebonden scFvs te detecteren. Gebruik een mierikswortel peroxidase (HRP) geconjugeerd primair antilichaam dat bindt aan de FLAG epitoop tag gefuseerd met de bibliotheek scFvs. Verdun het antilichaam aan de geschikte verdunning gebruikt in een ELISA (zie leverancier en #39; s aanbevelingen) in 2% (w / v) melkpoeder in 0,05% polysorbaat 20 in 1 x PBS. Bereid 5 ml voor elke plaat. Was de ELISA platen vier maal met wasbuffer zoals beschreven in stap 5.5.4. Voeg 50 ul van de oplossing met antilichaam aan elk putje van de ELISA plaat. Incubeer gedurende 1-2 uur bij KT. Bereid de HRP substraat door het oplossen van o-fenyleendiamine dihydrochloride (OPD) tabletten in gedestilleerd H2O per protocol van de fabrikant met vermijding licht. Bereid 20 ml per ELISA-plaat. Bereid 3 MH 2 SO 4 door het verdunnen van geconcentreerd H 2 SO 4 met gedestilleerd H 2 O als dat nodig is. Bereid 5 ml per ELISA-plaat. Voorzichtig: H 2 SO 4 is een sterk zuur. Zorg ervoor dat u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen. Was de ELISA platen viermaal gewassen met wasbuffer, zoals beschreven in stap 5.5.4. Incubeer ELISA platen met de HRP Substrate. Voeg 200 ul van het HRP substraat aan elk putje. Om blootstelling aan licht te minimaliseren, voegen de ondergrond een ELISA-plaat in een tijd, en wikkel met aluminiumfolie alvorens over te gaan naar de volgende plaat. Incubeer de platen gedurende 30 tot 60 min bij kamertemperatuur in het donker. Na de eerste 30 minuten, controleer de platen donker worden van het substraat en incubeer langer indien nodig te visualiseren ontwikkeling van kleur. Voeg 50 ul van 3 MH 2 SO 4 aan elk putje om de reactie te blussen. Met behulp van een andere tip voor elk putje, meng de oplossing in de putten door voorzichtig en neer te pipetteren zonder schuimen. Consistentie en verzadiging voorkomen, voeg H 2 SO 4 snel en zorgvuldig alle ELISA-platen vóór het mengen van de oplossing voor elke plaat. Meet de absorptie van de oplossing in de putjes van elke plaat bij 492 nm met een plaatlezer. Analyseer de absorptiegegevens identificeren scFv varianten die exhibHet veelbelovende binding signalen en karakteriseren van deze veelbelovende scFvs. Selecteer scFvs die absorptie signalen boven het achtergrondsignaal en hoger dan het gemiddelde signaal op elke plaat vertonen. OPMERKING: De absorptie niveau afhankelijk van de eigenschappen van het antigen en anti-FLAG antilichaam dat, samen met de kracht van de scFv varianten die werden geïsoleerd uit de screening.