Misurazione<em> In Vitro</em> Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

Replicazione dell'HIV-1 nella cella di destinazione prevede più passaggi, in linea di massima raggruppati in due fasi: eventi precoci e tardive. Gli eventi precoci iniziano quando HIV-1 in sequenza si lega alla superficie del recettore cellula bersaglio CD4 e una delle due co-recettori (CCR5 o CXCR4) ^1. Di conseguenza, le membrane fusibile virus-cellula, e il capside virale (CA) nucleo viene rilasciato nel citoplasma ^2. Il nucleo CA contiene il genomico RNA virale a singolo filamento (ssRNA) e diverse proteine, sia virali e cellulare in origine. Le proteine ​​virali CA-associati includono trascrittasi inversa (RT) e integrasi (IN), due enzimi che mediano passaggi critici durante eventi precoci nella replicazione virale. La RT ed in funzione nel contesto di complessi nucleoproteina, cioè la trascrizione inversa Complex (RTC) e il complesso di pre-integrazione (PIC), rispettivamente ^{3, 4, 5} <sup>, ^6. Le estremità del virale ssRNA genoma porto terminale di ripetizione (R) elementi adiacenti alla unica sequenze U5 (al 5 ') e U3 (al 3'). Il RTC converte il genoma virale ssRNA in un (ds) copia di DNA a doppia elica (vDNA). Questo processo di trascrizione inversa provoca anche la duplicazione delle U5 e U3 sequenze, generando così ripetizioni terminali lunghe (LTR) ad entrambe le estremità del vDNA ^{7, 8.} Successivamente, il IN PIC-associata catalizza due reazioni biochimiche sequenziali che consentono l'integrazione del vDNA nel cromosoma ospite ^{9, 10, 11.} Innanzitutto, nel citoplasma, IN multimeri coinvolgere sia LTR ¹² e fendere un dinucleotide da ciascuna delle estremità 3'-terminali. Questa elaborazione 3'-end genera un gruppo ossidrilico ad ogni 3'-end (CA _OH) del vDNA.Avanti, PIC traffici al nucleo, in cui IN utilizza il vDNA CA _OH come nucleofilo per tagliare entrambi i filamenti di DNA cromosomico in modo sfalsato. Contemporaneamente, IN giunzioni coordinatamente due estremità del vDNA ai legami fosfodiestere risultanti sui filamenti opposti del DNA cromosomico. A seguito di questa fase di trasferimento filone, il macchinario cellula ospite rimuove i due nucleotidi spaiati alle estremità 5 'del vDNA e riparazioni le conseguenti lacune singolo filamento allo svincolo del sito di integrazione. I primi eventi culminano quindi con la creazione di una copia di DNA integrato (provirus) del virus HIV-1 genoma. Il provirus fornisce un ambiente adatto per l'espressione genica virale efficiente, che avvia eventi successivi, compreso l'espressione delle proteine ​​virali codificate; assemblaggio del virus immaturo; e in erba, il rilascio e la maturazione in virioni infettivi ^13.

Purificata ricombinante retrovirale IN è competente aeffettuare, in vitro, sia attività di trasformazione e di trasferimento filo 3'-end in modo esogeno forniti LTR-come il DNA substrato. Studi biochimici utilizzando tali ricombinante purificata hanno rivelato aspetti critici vDNA integrazione ^{14, 15, 16, 17.} Tuttavia, a differenza di infezione naturale, questa reazione biochimica in vitro non supporta l'integrazione concertata di entrambe le estremità del DNA substrato nel DNA bersaglio. Al contrario, i PIC retrovirali isolate da cellule con infezione acuta concertata integrano entrambe le estremità della vDNA endogena nel DNA bersaglio eterologo. Ciò ha portato alla diffusa adozione e le successive raffinatezze di saggi in vitro Integration (IVI) I n usando isolati PIC nativi.

Nel primo saggio riportato retrovirale IVI, estratti citoplasmatici di cellule infettate con un murino ricombinanteLeukemia Virus (MLV) ospitare il gene E. coli supF nella sua LTR servito come fonte di attività IN, e il DNA di fago lambda mutante difettoso in crescita litico fu esogenamente forniti come il DNA bersaglio. Successful integrazione del ricombinante MLV DNA copia nel DNA fagico e l'espressione conseguente supF portato al ripristino della capacità di formazione di placca dei fagi ricombinanti. Tuttavia, questa strategia sperimentale è laboriosa e misure di integrazione in maniera indiretta. Per far fronte a tali avvertimenti, un test indiretto end-etichettatura Southern Blot-based, che quantifica l'attività IVI PIC-associata come misura della vDNA endogena integrato in esogeni batteriofago linearizzato phiX174 DNA, è stato sviluppato ^{6, 7, 18.} Anche se questo metodo fornisce una misura diretta di eventi di integrazione, sono necessarie quantità relativamente elevate di preparazione PIC, che rimane tecnicamente difficilesforzo. Per aggirare questo, sono stati sviluppati test basati sulla PCR nested che richiedono solo modeste quantità di PIC ^{4, 5, 19.}

In questo rapporto, descriviamo una versione aggiornata di un nested PCR-based metodo in vitro ideato per ricapitolare l'attività di integrazione di HIV-1 PIC-mediata che si verificano durante l'infezione naturale. Questo metodo utilizza gli estratti citoplasmatici delle cellule bersaglio HIV-1-infetti come fonte di attività PIC endogena, che viene misurata con un tempo reale Polymerase Chain Reaction quantitativa (qPCR). Le procedure per isolare PIC e misurare le loro attività di integrazione sono adattati, con modificazioni, dalla protocolli pubblicati dal laboratorio Engelman ^20. In questo metodo, l'attività di integrazione PIC-associato viene avviato fornendo un target DNA esogeno lineari ^21, ed i prodotti di DNA risultanti dallaquesta reazione integrazione sono purificate e utilizzato come materiale di partenza per la quantificazione successiva basata sulla PCR. Nel primo turno convenzionale PCR, le giunzioni del DNA virale bersaglio sono amplificati utilizzando primer appropriati. Nel secondo turno qPCR, primer LTR-specifici vengono utilizzati per arricchire specificamente la popolazione vDNA dal primo turno di PCR prodotti. Vedere la sezione protocollo per una descrizione dettagliata di questo metodo.

Studi in vitro con PIC retrovirali hanno portato a significativi progressi nella nostra comprensione del meccanismo di integrazione del DNA retrovirale e nello sviluppo di inibitori IN. Sulla base della recente maggiore attenzione alla mappatura di HIV-1 siti di integrazione, determinare il ruolo dei fattori virali e dell'ospite in HIV-1 integrazione e lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali alla lotta contro la resistenza ai farmaci, prevediamo un crescente interesse e l'uso diffuso di IVI saggi , come quello descritto in questa relazione. Questo, a sua volta, porterà afuturi perfezionamenti nel metodo, diversificando in tal modo la portata delle sue applicazioni.