والطريقة غير الغازية ومن الناحية الفنية غير كثيفة للتحريض وPhenotyping التجريبية البكتيرية والالتهاب الرئوي في الفئران
Summary
وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب لنمذجة الالتهاب الرئوي الجرثومي في الفئران. هنا، نحن تصف غير الغازية، وغير مكلفة، طريقة سريعة لإحداث الالتهاب الرئوي عن طريق الطموح (أي استنشاق) من اللقاح البكتيري pipetted في البلعوم. طرق المصب لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية هي أيضا مفصلة.
Abstract
على الرغم من أن الالتهاب الرئوي المكتسب من المجتمع لا يزال يمثل مشكلة صحية عامة رئيسية، ونماذج الفئران من الالتهاب الرئوي البكتيري قد سهلت مؤخرا التقدم قبل السريرية كبيرة في فهمنا للالمرضية الخلوية والجزيئية الكامنة. والنماذج الحية الماوس التقاط علم وظائف الأعضاء المتكاملة ومرونة الاستجابة دفاع المضيف في بطريقة لم تكشف من قبل، فيفو النهج السابق مبسطة بديلة. وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب للتلقيح داخل الرئة من البكتيريا في الفئران، بما في ذلك هباء، والتسليم داخل الأنف، بطريق الفم إقناء؛ إدخال القنية القصبة الهوائية في ظل ظروف "العمياء" وتصور، وعبر الجلد إقناء؛ إدخال القنية القصبة الهوائية. كل الطرق لها المزايا النسبية والقيود. هنا، نحن تصف بالتفصيل طريقة غير الغازية، من الناحية الفنية غير كثيفة، وغير مكلفة، وسريع للتسليم داخل القصبة الهوائية من البكتيريا التي ينطوي الطموح (أي استنشاق) عن طريق الماوسلقيحة المعدية pipetted في البلعوم وهو تحت التخدير العام. هذه الطريقة يمكن استخدامها لتسليم الرئوي من مجموعة واسعة من العوامل البيولوجية والكيميائية غير الكاوية، وسهلة نسبيا للتعلم، حتى بالنسبة للمختبرات لديهم خبرة سابقة الحد الأدنى للإجراءات الرئوية. بالإضافة إلى وصف طريقة الالتهاب الرئوي التنفسي، ونحن نقدم أيضا إجراءات خطوة بخطوة لمعايرة اللاحقة في الجسم الحي الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية من الفأرة، على وجه الخصوص، وأساليب لقياس إزالة البكتيريا والاستجابة المناعية الخلوية من مجرى الهواء المصاب. هذا نهج متكامل وبسيط لتقييم التهاب رئوي يسمح للتقييم السريع والقوي للتأثير التلاعب الوراثية والبيئية على الحصانة الفطرية الرئوية.
Introduction
لا يزال المجتمع المكتسبة الالتهاب الرئوي هو السبب الرئيسي للوفاة من العدوى في الولايات المتحدة، مع تغير ضئيل عموما في معدلات الوفيات على مدى السنوات ال 40 الماضية على الرغم من التحسينات في التطعيم واستراتيجيات المضادات الحيوية 1،2. وعلى الرغم من عدم إحراز تقدم ملموس على مستوى الصحة العامة، في السنوات الأخيرة تم إحراز تقدم كبيرة في فهمنا للالمرضية الجزيئية والخلوية من الالتهاب الرئوي، مع العديد من هذه الخطوات جعل الأمام ممكن عن طريق استخدام نماذج الماوس من التهاب في الرئتين. وقابلية الإستطراق الوراثي للفأرة، والتشابه من الفئران وجهاز المناعة البشرية، ومجموعة واسعة من الكواشف المناعية التي تستهدف الفئران التي أصبحت متاحة تجاريا سهلت معا التقدم السريع في هذا المجال.
وقد اعتمدت نماذج الماوس من الالتهاب الرئوي الجرثومي وصفها في الأدب عموما على واحد من أربعة مسارات التقنية للتلقيح الممرض: ط) هباء. ب) INTRتسليم anasal. ج) تسليم بطريق الفم. والرابع) الحقن داخل الرغامى الجراحية (أي القصبة الهوائية) 3. جميع طرق العدوى لها مزايا وعيوب 3. ولا سيما، والتعرض النسبي لمجرى الهواء العلوي، وقدرتها على خليط من النباتات فموي أنفي، ومتطلبات للتخدير العام، وتقلب من اللقاح تسليمها إلى الرئة البعيدة، توزيع فصي من مسببات الأمراض تسليمها، ومتطلبات الخبرة التقنية، والاعتلال الإجرائي تختلف على نطاق واسع عبر هذه اقتراب.
عادة تشمل استخدام تقنيات عدوى الفم؛ بالفم القصبة الهوائية (translaryngeal) إقناء؛ إدخال القنية إما عن طريق نهج "أعمى" (غير تصور)، أو تحت الحنجرة مباشرة تصور 3-5. كلتا الطريقتين، بينما قوية، تتطلب قدرا كبيرا من التدريب وتحمل أيضا خطر الصدمة لمجرى الهواء العلوي. في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا فنيا غير كثيفة، غير الغازية، وغير مكلفة، وسريع العدوى بطريق الفم، ثpipetted البكتيريا بموجب (الكلبسيلة الرئوية في المثال المقدمة) في البلعوم من الماوس تخدير يتم تسليمها إلى الرئتين عن طريق الطموح (أي استنشاق). نحن وآخرون استخدموا تقنية الالتهاب الرئوي التنفسي بنجاح 6-9. ويمكن تمديد هذه الطريقة الرئة التسليم تنوعا وتعلمت بسهولة إلى تقديم العديد من وكلاء غير الكاوية إضافية إلى الرئتين، بما في ذلك السيتوكينات والبروتينات الأخرى، الجزيئات المرتبطة الممرض (على سبيل المثال، lipopolysaccharide في)، والخلايا (أي نقل بالتبني)، والسموم (مثل بليوميسين). بالإضافة إلى مناقشة الاعتبارات الفنية الهامة، ونحن أيضا وصف نهج متكامل، الكمي لتقييم استجابة المضيف لاحقة إلى الالتهاب الرئوي، بما في ذلك قياس المصب إزالة البكتيريا (أي مستعمرة تشكيل وحدة [كفو] الكميات في الرئة والطرفية الأجهزة) والكريات البيض تراكم في المجال الجوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نماذج الفئران من الالتهاب الرئوي الجرثومي، في شراكة مع استهداف الجينات وفي التدخلات البيولوجية والدوائية الجسم الحي، وقدمت أفكارا هامة في الاستجابة دفاع المضيف الرئوية. وقد تقدما كبيرا ولا سيما في فهمنا للكيموكينات وجزيئات الالتصاق التي تحكم توظيف العدل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).
Materials
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
References
- Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
- Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
- Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
- Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
- Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
- Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
- Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
- Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
- Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
- Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
- Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
- Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
